La terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDa) utiliza luz visible para eliminar microorganismos patógenos con la ayuda de un fármaco fotoactivable. La interacción de este agente fotosensibilizador (FS) con luz y oxígeno conduce a la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO) inductoras de la muerte de los agentes infecciosos a erradicar. Al no utilizar una diana celular concreta, es muy difícil que las células generen resistencias al fármaco fotosensibilizante empleado1.

La TFDa es especialmente atractiva gracias a su selectividad; esto es consecuencia tanto de poder disponer de FS con una afinidad preferente por las células microbianas respecto al tejido del huésped, como de que el efecto fotodinámico se restringe a la zona tratada con luz2.

Trichophyton mentagrophytes es un hongo dermatofito capaz de invadir la capa córnea de la epidermis y estructuras queratinizadas, como pelo y uñas, causando micosis cutáneas conocidas comúnmente como tiñas3,4. Los tratamientos actuales se basan mayoritariamente en el uso de agentes antifúngicos que, sobre todo cuando deben emplearse por vía oral, pueden ocasionar efectos secundarios indeseables5.

El nuevo azul de metileno (NMB) es una fenotiazina plana tricíclica con potencial fototerapéutico, ya que su longitud de onda de absorción se encuentra dentro del margen donde se da la máxima penetración de la luz en el tejido del huésped (entre 600-850nm)6,7. En soluciones acuosas tamponadas el NMB absorbe luz a 630nm y emite fluorescencia a 650nm.

El objetivo de este trabajo es la optimización del método para la fotoinactivación in vitro de T. mentagrophytes utilizando el nuevo azul de metileno como FS.

Se ha evaluado la optimización in vitro de los factores a emplear en la TFDa con NMB frente a T. mentagrophytes (concentración del FS, tiempo de contacto y tiempo de irradiación) mediante la disminución de la viabilidad celular expresado como reducción logarítmica del número UFC/ml a partir de suspensiones celulares iniciales de ∼106UFC/ml. La exposición del hongo a la luz en ausencia del FS no inhibió su crecimiento en cualquiera de las 3 fluencias de luz empleadas (datos no mostrados). El ensayo de toxicidad a oscuras demuestra que el NMB solo es tóxico para el dermatofito si se combina con luz (función roja de la fig. 2).

Figura 2.

Reducción logarítmica del número de UFC/ml de Trichophyton mentagrophytes después del tratamiento fotodinámico con nuevo azul de metileno (NMB) irradiando la muestra entre 620 y 645nm.

Panel A: tiempo de contacto de 10min. Panel B: tiempo de contacto de 30min. Panel C: tiempo de contacto de 90min. En todos los paneles: control de la luz (función roja); fluencia de 9J/cm-2 (función verde); fluencia de 27J/cm-2 (función rosa); fluencia de 81J/cm-2 (función azul). Panel D: resumen de resultados para los tiempos de contacto ensayados: 10min (línea fina); 30min (línea punteada); 90min (línea gruesa).

(0.27MB).

Los resultados expuestos en la figura 2 indican que las concentraciones de 0, 0,1 y 1μM de NMB no producen efecto fungicida sobre T. mentagrophytes, ya que se obtiene un cultivo confluente después de irradiar la muestra para todos los tiempos de incubación e irradiación ensayados. No obstante, aplicando concentraciones de 10 y 25μM de NMB ya se detecta un efecto inhibidor del crecimiento que, en algunas condiciones, llega a alcanzar una reducción de hasta 5 unidades logarítmicas en el número UFC/ml, no lográndose en ningún caso la inhibición total del hongo. La erradicación de todas las colonias se pudo conseguir aplicando concentraciones de FS más elevadas: 50, 75 y 100μM, combinadas con los tiempos de incubación e irradiación más largos empleados. Por último, si se irradia la muestra con NMB 1000μM se produce un efecto fungicida total para cualquier combinación de las experiencias ensayadas para esta concentración.

Así que, de los resultados obtenidos al aplicar TFDa sobre suspensiones celulares de T. mentagrophytes (106 UFC/ml), puede extraerse que con un tiempo de agitación e irradiación de 10min (9J/cm-2) la concentración mínima de NMB que produce total mortandad celular es de 100μM, en cambio, para el mismo tiempo de contacto, si se irradia la muestra durante 90min (81J/cm-2) puede disminuirse la concentración de NMB hasta 50μM.

Hasta la fecha se han realizado diferentes estudios in vitro utilizando la TFD como posible tratamiento contra las dermatofitosis; la mayoría de ellos se basan en el empleo del ácido 5-aminolevuínico o sus derivados como FS8. En particular, para las onicomicosis el dermatofito más estudiado ha sido Trichophyton rubrum. Así, varias publicaciones científicas demuestran que T. rubrum puede ser tratado in vitro mediante TFD para obtener un efecto fungicida con distintos FS, como el azul de toluidina (toluidine blue O)9, Sylsens B —tricloruro de 5,10,15-tris(4-metilpiridinio)-20-fenil-[21H,23H]-porfina—10–14, deuteroporfirina monometiléster10–12, el ácido 5-aminolevulínico14,15 o la hipericina —1,3,4,6,8,13-hexahidroxi-10,11-dimetilfenantro(1,10,9,8-opqra)perilen-7,14-diona—16.

Sin embargo, son escasos los estudios publicados para tratar las micosis producidas por T. mentagrophytes con TFDa. Jenefar et al.17 demostraron en 2010 que este dermatofito puede ser tratado mediante TFDa utilizando acriflavina a una concentración de 0,2μM, aunque cabe resaltar que no menciona la dosis de luz aplicada. Paz-Cristobal et al.16 también consiguieron inactivar a T. mentagrophytes utilizando hipericina a una concentración entre 20 y 50μM usando diferentes dosis de luz. Es difícil comparar nuestros resultados con los de estos autores, porque tanto los fotosensibilizadores como las condiciones experimentales empleadas son muy diferentes. Asimismo, frente a T. mentagrophytes se han utilizado colorantes de la familia de las fenotiazinas como el NMB18.

Las fenotiazinas han resultado ser útiles en la TFD también frente a distintos tipos de bacterias, como la gram-positiva Staphylococcus aureus o la gram-negativa Escherichia coli19,20. De entre ellas, se ha demostrado que el NMB es más eficaz que el azul de metileno, el azul de toluidina O, o el azul de dimetilometileno frente a cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a antibióticos21. Sin embargo, la concentración de NMB necesaria para producir un efecto bactericida sobre Acinetobacter baumannii (2μM con dosis de luz de 30J/cm-2) es muy inferior a la necesaria para inactivar a T. mentagrophytes CECT 2956, según los resultados obtenidos en este trabajo (50 o 100μM a 81 o 9J/cm-2, respectivamente).

Es un dato conocido que las células de mayor tamaño son menos sensibles a la TFDa que las más pequeñas, hecho que convierte a los eucariotas en más resistentes a la fotoinactivación que las bacterias al poseer un mayor número de blancos por célula22. Además, en TFD está generalmente aceptado que el mecanismo tipo ii vía oxígeno singlete (1O2) es la vía principal que causa el daño celular. El 1O2 es una ERO que no se interconvierte con otras ERO, por lo que su principal característica, en relación con su efecto fotodinámico, es su tiempo de vida antes de que regrese a su estado fundamental al transferir su energía. No está claro el valor de este parámetro en el ambiente celular donde el 1O2 puede reaccionar con diferentes biomoléculas pero, en cualquier caso, su tiempo de vida útil limita el espacio en que puede moverse a partir del lugar donde es generado y que se calcula en alrededor de 270nm23. Esto es una distancia muy corta, incluso en la escala de las dimensiones celulares. Un procariota típico tiene una longitud de unos pocos micrómetros, mientras que las eucariotas a menudo alcanzan diámetros de 10-30μm. En particular, los macroconidios de T. mentagrophytes alcanzan un tamaño de 20-50μm de largo y 6-8μm de ancho cuando se desarrollan sobre un huésped. En consecuencia, las reacciones primarias del 1O2 en una célula tienen lugar en una corta distancia de donde se ha generado, por lo que a nivel molecular, el lugar donde se genera es muy importante. Las reacciones primarias del 1O2 con las células vecinas produce ERO secundarias capaces de difundir y provocar un mayor daño oxidativo en las células24.

En el trabajo publicado por Rodrigues et al.18 los autores exponen que el tratamiento de T. mentagrophytes ATCC 9533 con NMB a una concentración de 10μM, con un tiempo de incubación de 30min y una dosis de luz de 20J/cm-2, es suficiente para conseguir que ningún superviviente del dermatofito se desarrolle. Como se ha mostrado en nuestro estudio, la dosis de 10μM no resultó suficiente en ningún caso para erradicar a la cepa CECT 2956 (ATCC 28443). La comparación de ambos datos apunta a que la susceptibilidad a la TFDa es cepa-dependiente, ya que en ambos casos el tiempo de incubación de las suspensiones fototratadas de forma similar, sembradas e incubadas sobre SB, fue de 14 días.

Por último, cabe mencionar que debido a que el estudio se ha realizado in vitro, no pueden extrapolarse sus resultados directamente para el tratamiento de las infecciones fúngicas en pacientes. Las dificultades experimentales no han permitido estudiar los efectos fotodinámicos sobre las hifas de T. mentagrophytes ni sobre sus macroconidios, ya que estos raramente son generados por el dermatofito cuando se cultiva en el laboratorio. Sin embargo, los resultados demuestran que el NMB es un FS a tener en cuenta para el tratamiento de las micosis cutáneas causadas por este dermatofito.

Este trabajo se ha realizado con la ayuda recibida del Ministerio de Economía y Competitividad de España (CTQ2010-20870-C03-01 y CTQ2013-48767-C3-1-R).

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses