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esto es consecuencia tanto de poder disponer de FS con una afinidad preferente por las c&#233;lulas microbianas respecto al tejido del hu&#233;sped&#44; como de que el efecto fotodin&#225;mico se restringe a la zona tratada con luz<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton mentagrophytes</span> es un hongo dermatofito capaz de invadir la capa c&#243;rnea de la epidermis y estructuras queratinizadas&#44; como pelo y u&#241;as&#44; causando micosis cut&#225;neas conocidas com&#250;nmente como ti&#241;as<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;4</span></a>&#46; Los tratamientos actuales se basan mayoritariamente en el uso de agentes antif&#250;ngicos que&#44; sobre todo cuando deben emplearse por v&#237;a oral&#44; pueden ocasionar efectos secundarios indeseables<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El nuevo azul de metileno &#40;NMB&#41; es una fenotiazina plana tric&#237;clica con potencial fototerap&#233;utico&#44; ya que su longitud de onda de absorci&#243;n se encuentra dentro del margen donde se da la m&#225;xima penetraci&#243;n de la luz en el tejido del hu&#233;sped &#40;entre 600-850<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">6&#44;7</span></a>&#46; En soluciones acuosas tamponadas el NMB absorbe luz a 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm y emite fluorescencia a 650<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objetivo de este trabajo es la optimizaci&#243;n del m&#233;todo para la fotoinactivaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> utilizando el nuevo azul de metileno como FS&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Material y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Reactivos qu&#237;micos</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El FS NMB <span class="elsevierStyleItalic">&#40;new methylene blue&#41;</span> y el tamp&#243;n fosfato &#40;&#91;PBS&#93; Sterile dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline pH 7&#46;4&#41; fueron adquiridos en SIGMA-Aldrich&#44; Inc&#46; &#40;St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46; UU&#46;&#41;&#46; La estructura del NMB se muestra en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El medio de cultivo f&#250;ngico&#44; agar de Saboraud &#40;SB&#41;&#44; fue preparado a partir de Sabouraud Dextrose Agar CM0041 pH 5&#44;6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;2 &#40;Oxoid Limited&#44; Basingstoke&#44; Reino Unido&#41;&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La disoluci&#243;n madre de NMB 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM fue preparada en agua tamponada est&#233;ril &#40;PBS&#44; pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>7&#44;4&#41;&#46; Las disoluciones de trabajo de NMB se disolvieron a oscuras en PBS hasta la concentraci&#243;n deseada y se almacenaron a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Cepa f&#250;ngica&#44; condiciones de cultivo y preparaci&#243;n de las suspensiones celulares</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha utilizado la cepa de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956 obtenida de la Colecci&#243;n espa&#241;ola de cultivos tipo &#40;Valencia&#44; Espa&#241;a&#41;&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los cultivos de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956 se realizaron en SB y se incubaron aer&#243;bicamente y en oscuridad a 26<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 14 d&#237;as&#46; Una vez crecidas las colonias&#44; estas se desprendieron de la superficie del medio de cultivo s&#243;lido por agitaci&#243;n manual mediante una soluci&#243;n salina est&#233;ril con bolas de cristal de 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm de di&#225;metro&#46; La suspensi&#243;n celular fue filtrada a trav&#233;s de gasa est&#233;ril&#46; Las suspensiones de trabajo se ajustaron a un nivel de concentraci&#243;n de aproximadamente 10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml en soluci&#243;n salina est&#233;ril&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Fuente de luz</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes fue irradiado con una l&#225;mpara LED Photocare &#40;SORISA&#44; Sant Quirze del Vall&#232;s&#44; Espa&#241;a&#41;&#46; Para excitar el NMB se seleccion&#243; una emisi&#243;n roja entre 620 y 645<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm</span>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Dise&#241;o de experiencias para optimizar el protocolo de fotoinactivaci&#243;n del dermatofito T&#46; mentagrophytes</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La optimizaci&#243;n del protocolo para la fotoinactivaci&#243;n de c&#233;lulas de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> mediante TFDa se realiz&#243; aplicando el dise&#241;o experimental completo resultado de la combinaci&#243;n de 3 variables aplicadas a diferentes niveles&#58; concentraci&#243;n final de NMB &#40;niveles&#58; 0&#44; 0&#44;1&#44; 1&#44; 10&#44; 25&#44; 50&#44; 75&#44; 100 y 1000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#41;&#44; tiempo de incubaci&#243;n del FS en contacto con el hongo &#40;niveles&#58; 0&#44; 10&#44; 30 y 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41; y tiempo de irradiaci&#243;n &#40;niveles&#58; 0&#44; 10&#44; 30 y 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41;&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> se detallan las experiencias realizadas&#46; En resumen&#44; para cada una de las 9 concentraciones de NMB ensayadas se llevaron a cabo 16 experiencias&#44; lo que dio un total de 144 experiencias&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Experimentos de fotoinactivaci&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton mentagrophytes</span></span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A cada una de las suspensiones de trabajo&#44; de aproximadamente 10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml&#44; se adicion&#243; una de las concentraciones de NMB&#44; se incub&#243; a oscuras durante 10&#44; 30 o 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y 120<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>r&#46;p&#46;m&#46; Transcurrida la incubaci&#243;n&#44; para excitar la banda de 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm del NMB se irradi&#243; la muestra&#44; sin lavado previo del FS en exceso&#44; entre 620 y 645<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm mediante la fuente de luz durante 10&#44; 30 o 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; correspondiente a una fluencia de 9&#44; 27 y 81<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; respectivamente&#46;</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalizado el tratamiento de luz se sembraron 0&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de la suspensi&#243;n sobre placas de Petri que conten&#237;an SB&#44; se incub&#243; en oscuridad a 26<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 14 d&#237;as y se realiz&#243; el recuento de las colonias formadas despu&#233;s del tratamiento fotodin&#225;mico&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El control de toxicidad de la luz &#40;sin FS&#41; y la toxicidad del FS &#40;sin luz&#41; se realiz&#243; para cada ensayo y en las mismas condiciones en que se realizaron los experimentos&#46;</p></span></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Resultados</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha evaluado la optimizaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de los factores a emplear en la TFDa con NMB frente a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> &#40;concentraci&#243;n del FS&#44; tiempo de contacto y tiempo de irradiaci&#243;n&#41; mediante la disminuci&#243;n de la viabilidad celular expresado como reducci&#243;n logar&#237;tmica del n&#250;mero UFC&#47;ml a partir de suspensiones celulares iniciales de &#8764;10<span class="elsevierStyleSup">6</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UFC&#47;ml&#46; La exposici&#243;n del hongo a la luz en ausencia del FS no inhibi&#243; su crecimiento en cualquiera de las 3 fluencias de luz empleadas &#40;datos no mostrados&#41;&#46; El ensayo de toxicidad a oscuras demuestra que el NMB solo es t&#243;xico para el dermatofito si se combina con luz &#40;funci&#243;n roja de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los resultados expuestos en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a> indican que las concentraciones de 0&#44; 0&#44;1 y 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de NMB no producen efecto fungicida sobre <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span>&#44; ya que se obtiene un cultivo confluente despu&#233;s de irradiar la muestra para todos los tiempos de incubaci&#243;n e irradiaci&#243;n ensayados&#46; No obstante&#44; aplicando concentraciones de 10 y 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de NMB ya se detecta un efecto inhibidor del crecimiento que&#44; en algunas condiciones&#44; llega a alcanzar una reducci&#243;n de hasta 5 unidades logar&#237;tmicas en el n&#250;mero UFC&#47;ml&#44; no logr&#225;ndose en ning&#250;n caso la inhibici&#243;n total del hongo&#46; La erradicaci&#243;n de todas las colonias se pudo conseguir aplicando concentraciones de FS m&#225;s elevadas&#58; 50&#44; 75 y 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; combinadas con los tiempos de incubaci&#243;n e irradiaci&#243;n m&#225;s largos empleados&#46; Por &#250;ltimo&#44; si se irradia la muestra con NMB 1000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M se produce un efecto fungicida total para cualquier combinaci&#243;n de las experiencias ensayadas para esta concentraci&#243;n&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As&#237; que&#44; de los resultados obtenidos al aplicar TFDa sobre suspensiones celulares de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> &#40;10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml&#41;&#44; puede extraerse que con un tiempo de agitaci&#243;n e irradiaci&#243;n de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min &#40;9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; la concentraci&#243;n m&#237;nima de NMB que produce total mortandad celular es de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; en cambio&#44; para el mismo tiempo de contacto&#44; si se irradia la muestra durante 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min &#40;81<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; puede disminuirse la concentraci&#243;n de NMB hasta 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Discusi&#243;n</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hasta la fecha se han realizado diferentes estudios <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> utilizando la TFD como posible tratamiento contra las dermatofitosis&#59; la mayor&#237;a de ellos se basan en el empleo del &#225;cido 5-aminolevu&#237;nico o sus derivados como FS<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; En particular&#44; para las onicomicosis el dermatofito m&#225;s estudiado ha sido <span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton rubrum</span>&#46; As&#237;&#44; varias publicaciones cient&#237;ficas demuestran que <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; rubrum</span> puede ser tratado <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> mediante TFD para obtener un efecto fungicida con distintos FS&#44; como el azul de toluidina <span class="elsevierStyleItalic">&#40;toluidine blue O&#41;</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#44; Sylsens B &#8212;tricloruro de 5&#44;10&#44;15-tris&#40;4-metilpiridinio&#41;-20-fenil-&#91;21H&#44;23H&#93;-porfina&#8212;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">10&#8211;14</span></a>&#44; deuteroporfirina monometil&#233;ster<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">10&#8211;12</span></a>&#44; el &#225;cido 5-aminolevul&#237;nico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">14&#44;15</span></a> o la hipericina &#8212;1&#44;3&#44;4&#44;6&#44;8&#44;13-hexahidroxi-10&#44;11-dimetilfenantro&#40;1&#44;10&#44;9&#44;8-opqra&#41;perilen-7&#44;14-diona&#8212;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; son escasos los estudios publicados para tratar las micosis producidas por <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> con TFDa&#46; Jenefar et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> demostraron en 2010 que este dermatofito puede ser tratado mediante TFDa utilizando acriflavina a una concentraci&#243;n de 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; aunque cabe resaltar que no menciona la dosis de luz aplicada&#46; Paz-Cristobal et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a> tambi&#233;n consiguieron inactivar a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> utilizando hipericina a una concentraci&#243;n entre 20 y 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M usando diferentes dosis de luz&#46; Es dif&#237;cil comparar nuestros resultados con los de estos autores&#44; porque tanto los fotosensibilizadores como las condiciones experimentales empleadas son muy diferentes&#46; Asimismo&#44; frente a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> se han utilizado colorantes de la familia de las fenotiazinas como el NMB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las fenotiazinas han resultado ser &#250;tiles en la TFD tambi&#233;n frente a distintos tipos de bacterias&#44; como la gram-positiva <span class="elsevierStyleItalic">Staphylococcus aureus</span> o la gram-negativa <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia coli</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span></a>&#46; De entre ellas&#44; se ha demostrado que el NMB es m&#225;s eficaz que el azul de metileno&#44; el azul de toluidina O&#44; o el azul de dimetilometileno frente a cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Acinetobacter baumannii</span> resistentes a antibi&#243;ticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; Sin embargo&#44; la concentraci&#243;n de NMB necesaria para producir un efecto bactericida sobre <span class="elsevierStyleItalic">Acinetobacter baumannii</span> &#40;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M con dosis de luz de 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; es muy inferior a la necesaria para inactivar a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956&#44; seg&#250;n los resultados obtenidos en este trabajo &#40;50 o 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M a 81 o 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; respectivamente&#41;&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es un dato conocido que las c&#233;lulas de mayor tama&#241;o son menos sensibles a la TFDa que las m&#225;s peque&#241;as&#44; hecho que convierte a los eucariotas en m&#225;s resistentes a la fotoinactivaci&#243;n que las bacterias al poseer un mayor n&#250;mero de blancos por c&#233;lula<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; en TFD est&#225; generalmente aceptado que el mecanismo tipo <span class="elsevierStyleSmallCaps">ii</span> v&#237;a ox&#237;geno singlete &#40;<span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#41; es la v&#237;a principal que causa el da&#241;o celular&#46; El <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> es una ERO que no se interconvierte con otras ERO&#44; por lo que su principal caracter&#237;stica&#44; en relaci&#243;n con su efecto fotodin&#225;mico&#44; es su tiempo de vida antes de que regrese a su estado fundamental al transferir su energ&#237;a&#46; No est&#225; claro el valor de este par&#225;metro en el ambiente celular donde el <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> puede reaccionar con diferentes biomol&#233;culas pero&#44; en cualquier caso&#44; su tiempo de vida &#250;til limita el espacio en que puede moverse a partir del lugar donde es generado y que se calcula en alrededor de 270<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; Esto es una distancia muy corta&#44; incluso en la escala de las dimensiones celulares&#46; Un procariota t&#237;pico tiene una longitud de unos pocos micr&#243;metros&#44; mientras que las eucariotas a menudo alcanzan di&#225;metros de 10-30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46; En particular&#44; los macroconidios de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> alcanzan un tama&#241;o de 20-50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m de largo y 6-8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m de ancho cuando se desarrollan sobre un hu&#233;sped&#46; En consecuencia&#44; las reacciones primarias del <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> en una c&#233;lula tienen lugar en una corta distancia de donde se ha generado&#44; por lo que a nivel molecular&#44; el lugar donde se genera es muy importante&#46; Las reacciones primarias del <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> con las c&#233;lulas vecinas produce ERO secundarias capaces de difundir y provocar un mayor da&#241;o oxidativo en las c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el trabajo publicado por Rodrigues et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a> los autores exponen que el tratamiento de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> ATCC 9533 con NMB a una concentraci&#243;n de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; con un tiempo de incubaci&#243;n de 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min y una dosis de luz de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; es suficiente para conseguir que ning&#250;n superviviente del dermatofito se desarrolle&#46; Como se ha mostrado en nuestro estudio&#44; la dosis de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M no result&#243; suficiente en ning&#250;n caso para erradicar a la cepa CECT 2956 &#40;ATCC 28443&#41;&#46; La comparaci&#243;n de ambos datos apunta a que la susceptibilidad a la TFDa es cepa-dependiente&#44; ya que en ambos casos el tiempo de incubaci&#243;n de las suspensiones fototratadas de forma similar&#44; sembradas e incubadas sobre SB&#44; fue de 14 d&#237;as&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por &#250;ltimo&#44; cabe mencionar que debido a que el estudio se ha realizado <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#44; no pueden extrapolarse sus resultados directamente para el tratamiento de las infecciones f&#250;ngicas en pacientes&#46; Las dificultades experimentales no han permitido estudiar los efectos fotodin&#225;micos sobre las hifas de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> ni sobre sus macroconidios&#44; ya que estos raramente son generados por el dermatofito cuando se cultiva en el laboratorio&#46; Sin embargo&#44; los resultados demuestran que el NMB es un FS a tener en cuenta para el tratamiento de las micosis cut&#225;neas causadas por este dermatofito&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Responsabilidades &#233;ticas</span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Protecci&#243;n de personas y animales</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que para esta investigaci&#243;n no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Confidencialidad de los datos</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este art&#237;culo no aparecen datos de pacientes&#46;</p></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Derecho a la privacidad y consentimiento informado</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este art&#237;culo no aparecen datos de pacientes&#46;</p></span></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Financiaci&#243;n</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este trabajo se ha realizado con la ayuda recibida del Ministerio de Econom&#237;a y Competitividad de Espa&#241;a &#40;CTQ2010-20870-C03-01 y CTQ2013-48767-C3-1-R&#41;&#46;</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Conflicto de intereses</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="" valign="top" scope="col">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</th></tr><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">30&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">90&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " colspan="5" align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">t</span><span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">incubaci&#243;n</span></span><span class="elsevierStyleItalic">&#47;min</span></td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>30&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 11&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Experiencia 13&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Original
Terapia fotodinámica antimicrobiana in vitro aplicada sobre Trichophyton mentagrophytes con nuevo azul de metileno como fotosensibilizador
In Vitro Antimicrobial Photodynamic Therapy Against Trichophyton mentagrophytes Using New Methylene Blue as the Photosensitizer
P. López-Chicón, Ò. Gulías, S. Nonell, M. Agut
Autor para correspondencia
montserrat.agut@iqs.url.edu

Autor para correspondencia.
Institut Quimic de Sarrià, Universitat Ramon Llull, Barcelona, España
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esto es consecuencia tanto de poder disponer de FS con una afinidad preferente por las c&#233;lulas microbianas respecto al tejido del hu&#233;sped&#44; como de que el efecto fotodin&#225;mico se restringe a la zona tratada con luz<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton mentagrophytes</span> es un hongo dermatofito capaz de invadir la capa c&#243;rnea de la epidermis y estructuras queratinizadas&#44; como pelo y u&#241;as&#44; causando micosis cut&#225;neas conocidas com&#250;nmente como ti&#241;as<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;4</span></a>&#46; Los tratamientos actuales se basan mayoritariamente en el uso de agentes antif&#250;ngicos que&#44; sobre todo cuando deben emplearse por v&#237;a oral&#44; pueden ocasionar efectos secundarios indeseables<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El nuevo azul de metileno &#40;NMB&#41; es una fenotiazina plana tric&#237;clica con potencial fototerap&#233;utico&#44; ya que su longitud de onda de absorci&#243;n se encuentra dentro del margen donde se da la m&#225;xima penetraci&#243;n de la luz en el tejido del hu&#233;sped &#40;entre 600-850<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">6&#44;7</span></a>&#46; En soluciones acuosas tamponadas el NMB absorbe luz a 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm y emite fluorescencia a 650<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objetivo de este trabajo es la optimizaci&#243;n del m&#233;todo para la fotoinactivaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> utilizando el nuevo azul de metileno como FS&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Material y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Reactivos qu&#237;micos</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El FS NMB <span class="elsevierStyleItalic">&#40;new methylene blue&#41;</span> y el tamp&#243;n fosfato &#40;&#91;PBS&#93; Sterile dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline pH 7&#46;4&#41; fueron adquiridos en SIGMA-Aldrich&#44; Inc&#46; &#40;St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46; UU&#46;&#41;&#46; La estructura del NMB se muestra en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El medio de cultivo f&#250;ngico&#44; agar de Saboraud &#40;SB&#41;&#44; fue preparado a partir de Sabouraud Dextrose Agar CM0041 pH 5&#44;6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;2 &#40;Oxoid Limited&#44; Basingstoke&#44; Reino Unido&#41;&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La disoluci&#243;n madre de NMB 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM fue preparada en agua tamponada est&#233;ril &#40;PBS&#44; pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>7&#44;4&#41;&#46; Las disoluciones de trabajo de NMB se disolvieron a oscuras en PBS hasta la concentraci&#243;n deseada y se almacenaron a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Cepa f&#250;ngica&#44; condiciones de cultivo y preparaci&#243;n de las suspensiones celulares</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha utilizado la cepa de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956 obtenida de la Colecci&#243;n espa&#241;ola de cultivos tipo &#40;Valencia&#44; Espa&#241;a&#41;&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los cultivos de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956 se realizaron en SB y se incubaron aer&#243;bicamente y en oscuridad a 26<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 14 d&#237;as&#46; Una vez crecidas las colonias&#44; estas se desprendieron de la superficie del medio de cultivo s&#243;lido por agitaci&#243;n manual mediante una soluci&#243;n salina est&#233;ril con bolas de cristal de 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm de di&#225;metro&#46; La suspensi&#243;n celular fue filtrada a trav&#233;s de gasa est&#233;ril&#46; Las suspensiones de trabajo se ajustaron a un nivel de concentraci&#243;n de aproximadamente 10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml en soluci&#243;n salina est&#233;ril&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Fuente de luz</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes fue irradiado con una l&#225;mpara LED Photocare &#40;SORISA&#44; Sant Quirze del Vall&#232;s&#44; Espa&#241;a&#41;&#46; Para excitar el NMB se seleccion&#243; una emisi&#243;n roja entre 620 y 645<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm</span>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Dise&#241;o de experiencias para optimizar el protocolo de fotoinactivaci&#243;n del dermatofito T&#46; mentagrophytes</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La optimizaci&#243;n del protocolo para la fotoinactivaci&#243;n de c&#233;lulas de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> mediante TFDa se realiz&#243; aplicando el dise&#241;o experimental completo resultado de la combinaci&#243;n de 3 variables aplicadas a diferentes niveles&#58; concentraci&#243;n final de NMB &#40;niveles&#58; 0&#44; 0&#44;1&#44; 1&#44; 10&#44; 25&#44; 50&#44; 75&#44; 100 y 1000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#41;&#44; tiempo de incubaci&#243;n del FS en contacto con el hongo &#40;niveles&#58; 0&#44; 10&#44; 30 y 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41; y tiempo de irradiaci&#243;n &#40;niveles&#58; 0&#44; 10&#44; 30 y 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41;&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> se detallan las experiencias realizadas&#46; En resumen&#44; para cada una de las 9 concentraciones de NMB ensayadas se llevaron a cabo 16 experiencias&#44; lo que dio un total de 144 experiencias&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Experimentos de fotoinactivaci&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton mentagrophytes</span></span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A cada una de las suspensiones de trabajo&#44; de aproximadamente 10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml&#44; se adicion&#243; una de las concentraciones de NMB&#44; se incub&#243; a oscuras durante 10&#44; 30 o 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y 120<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>r&#46;p&#46;m&#46; Transcurrida la incubaci&#243;n&#44; para excitar la banda de 630<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm del NMB se irradi&#243; la muestra&#44; sin lavado previo del FS en exceso&#44; entre 620 y 645<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm mediante la fuente de luz durante 10&#44; 30 o 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; correspondiente a una fluencia de 9&#44; 27 y 81<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; respectivamente&#46;</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalizado el tratamiento de luz se sembraron 0&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de la suspensi&#243;n sobre placas de Petri que conten&#237;an SB&#44; se incub&#243; en oscuridad a 26<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 14 d&#237;as y se realiz&#243; el recuento de las colonias formadas despu&#233;s del tratamiento fotodin&#225;mico&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El control de toxicidad de la luz &#40;sin FS&#41; y la toxicidad del FS &#40;sin luz&#41; se realiz&#243; para cada ensayo y en las mismas condiciones en que se realizaron los experimentos&#46;</p></span></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Resultados</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha evaluado la optimizaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de los factores a emplear en la TFDa con NMB frente a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> &#40;concentraci&#243;n del FS&#44; tiempo de contacto y tiempo de irradiaci&#243;n&#41; mediante la disminuci&#243;n de la viabilidad celular expresado como reducci&#243;n logar&#237;tmica del n&#250;mero UFC&#47;ml a partir de suspensiones celulares iniciales de &#8764;10<span class="elsevierStyleSup">6</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UFC&#47;ml&#46; La exposici&#243;n del hongo a la luz en ausencia del FS no inhibi&#243; su crecimiento en cualquiera de las 3 fluencias de luz empleadas &#40;datos no mostrados&#41;&#46; El ensayo de toxicidad a oscuras demuestra que el NMB solo es t&#243;xico para el dermatofito si se combina con luz &#40;funci&#243;n roja de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los resultados expuestos en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a> indican que las concentraciones de 0&#44; 0&#44;1 y 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de NMB no producen efecto fungicida sobre <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span>&#44; ya que se obtiene un cultivo confluente despu&#233;s de irradiar la muestra para todos los tiempos de incubaci&#243;n e irradiaci&#243;n ensayados&#46; No obstante&#44; aplicando concentraciones de 10 y 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de NMB ya se detecta un efecto inhibidor del crecimiento que&#44; en algunas condiciones&#44; llega a alcanzar una reducci&#243;n de hasta 5 unidades logar&#237;tmicas en el n&#250;mero UFC&#47;ml&#44; no logr&#225;ndose en ning&#250;n caso la inhibici&#243;n total del hongo&#46; La erradicaci&#243;n de todas las colonias se pudo conseguir aplicando concentraciones de FS m&#225;s elevadas&#58; 50&#44; 75 y 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; combinadas con los tiempos de incubaci&#243;n e irradiaci&#243;n m&#225;s largos empleados&#46; Por &#250;ltimo&#44; si se irradia la muestra con NMB 1000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M se produce un efecto fungicida total para cualquier combinaci&#243;n de las experiencias ensayadas para esta concentraci&#243;n&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">As&#237; que&#44; de los resultados obtenidos al aplicar TFDa sobre suspensiones celulares de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> &#40;10<span class="elsevierStyleSup">6</span> UFC&#47;ml&#41;&#44; puede extraerse que con un tiempo de agitaci&#243;n e irradiaci&#243;n de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min &#40;9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; la concentraci&#243;n m&#237;nima de NMB que produce total mortandad celular es de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; en cambio&#44; para el mismo tiempo de contacto&#44; si se irradia la muestra durante 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min &#40;81<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; puede disminuirse la concentraci&#243;n de NMB hasta 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Discusi&#243;n</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hasta la fecha se han realizado diferentes estudios <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> utilizando la TFD como posible tratamiento contra las dermatofitosis&#59; la mayor&#237;a de ellos se basan en el empleo del &#225;cido 5-aminolevu&#237;nico o sus derivados como FS<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; En particular&#44; para las onicomicosis el dermatofito m&#225;s estudiado ha sido <span class="elsevierStyleItalic">Trichophyton rubrum</span>&#46; As&#237;&#44; varias publicaciones cient&#237;ficas demuestran que <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; rubrum</span> puede ser tratado <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> mediante TFD para obtener un efecto fungicida con distintos FS&#44; como el azul de toluidina <span class="elsevierStyleItalic">&#40;toluidine blue O&#41;</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#44; Sylsens B &#8212;tricloruro de 5&#44;10&#44;15-tris&#40;4-metilpiridinio&#41;-20-fenil-&#91;21H&#44;23H&#93;-porfina&#8212;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">10&#8211;14</span></a>&#44; deuteroporfirina monometil&#233;ster<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">10&#8211;12</span></a>&#44; el &#225;cido 5-aminolevul&#237;nico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">14&#44;15</span></a> o la hipericina &#8212;1&#44;3&#44;4&#44;6&#44;8&#44;13-hexahidroxi-10&#44;11-dimetilfenantro&#40;1&#44;10&#44;9&#44;8-opqra&#41;perilen-7&#44;14-diona&#8212;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; son escasos los estudios publicados para tratar las micosis producidas por <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> con TFDa&#46; Jenefar et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> demostraron en 2010 que este dermatofito puede ser tratado mediante TFDa utilizando acriflavina a una concentraci&#243;n de 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; aunque cabe resaltar que no menciona la dosis de luz aplicada&#46; Paz-Cristobal et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a> tambi&#233;n consiguieron inactivar a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> utilizando hipericina a una concentraci&#243;n entre 20 y 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M usando diferentes dosis de luz&#46; Es dif&#237;cil comparar nuestros resultados con los de estos autores&#44; porque tanto los fotosensibilizadores como las condiciones experimentales empleadas son muy diferentes&#46; Asimismo&#44; frente a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> se han utilizado colorantes de la familia de las fenotiazinas como el NMB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las fenotiazinas han resultado ser &#250;tiles en la TFD tambi&#233;n frente a distintos tipos de bacterias&#44; como la gram-positiva <span class="elsevierStyleItalic">Staphylococcus aureus</span> o la gram-negativa <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia coli</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span></a>&#46; De entre ellas&#44; se ha demostrado que el NMB es m&#225;s eficaz que el azul de metileno&#44; el azul de toluidina O&#44; o el azul de dimetilometileno frente a cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Acinetobacter baumannii</span> resistentes a antibi&#243;ticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; Sin embargo&#44; la concentraci&#243;n de NMB necesaria para producir un efecto bactericida sobre <span class="elsevierStyleItalic">Acinetobacter baumannii</span> &#40;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M con dosis de luz de 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#41; es muy inferior a la necesaria para inactivar a <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> CECT 2956&#44; seg&#250;n los resultados obtenidos en este trabajo &#40;50 o 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M a 81 o 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; respectivamente&#41;&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es un dato conocido que las c&#233;lulas de mayor tama&#241;o son menos sensibles a la TFDa que las m&#225;s peque&#241;as&#44; hecho que convierte a los eucariotas en m&#225;s resistentes a la fotoinactivaci&#243;n que las bacterias al poseer un mayor n&#250;mero de blancos por c&#233;lula<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; en TFD est&#225; generalmente aceptado que el mecanismo tipo <span class="elsevierStyleSmallCaps">ii</span> v&#237;a ox&#237;geno singlete &#40;<span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#41; es la v&#237;a principal que causa el da&#241;o celular&#46; El <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> es una ERO que no se interconvierte con otras ERO&#44; por lo que su principal caracter&#237;stica&#44; en relaci&#243;n con su efecto fotodin&#225;mico&#44; es su tiempo de vida antes de que regrese a su estado fundamental al transferir su energ&#237;a&#46; No est&#225; claro el valor de este par&#225;metro en el ambiente celular donde el <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> puede reaccionar con diferentes biomol&#233;culas pero&#44; en cualquier caso&#44; su tiempo de vida &#250;til limita el espacio en que puede moverse a partir del lugar donde es generado y que se calcula en alrededor de 270<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; Esto es una distancia muy corta&#44; incluso en la escala de las dimensiones celulares&#46; Un procariota t&#237;pico tiene una longitud de unos pocos micr&#243;metros&#44; mientras que las eucariotas a menudo alcanzan di&#225;metros de 10-30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46; En particular&#44; los macroconidios de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> alcanzan un tama&#241;o de 20-50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m de largo y 6-8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m de ancho cuando se desarrollan sobre un hu&#233;sped&#46; En consecuencia&#44; las reacciones primarias del <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> en una c&#233;lula tienen lugar en una corta distancia de donde se ha generado&#44; por lo que a nivel molecular&#44; el lugar donde se genera es muy importante&#46; Las reacciones primarias del <span class="elsevierStyleSup">1</span>O<span class="elsevierStyleInf">2</span> con las c&#233;lulas vecinas produce ERO secundarias capaces de difundir y provocar un mayor da&#241;o oxidativo en las c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el trabajo publicado por Rodrigues et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a> los autores exponen que el tratamiento de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> ATCC 9533 con NMB a una concentraci&#243;n de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#44; con un tiempo de incubaci&#243;n de 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min y una dosis de luz de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>J&#47;cm<span class="elsevierStyleSup">-2</span>&#44; es suficiente para conseguir que ning&#250;n superviviente del dermatofito se desarrolle&#46; Como se ha mostrado en nuestro estudio&#44; la dosis de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M no result&#243; suficiente en ning&#250;n caso para erradicar a la cepa CECT 2956 &#40;ATCC 28443&#41;&#46; La comparaci&#243;n de ambos datos apunta a que la susceptibilidad a la TFDa es cepa-dependiente&#44; ya que en ambos casos el tiempo de incubaci&#243;n de las suspensiones fototratadas de forma similar&#44; sembradas e incubadas sobre SB&#44; fue de 14 d&#237;as&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por &#250;ltimo&#44; cabe mencionar que debido a que el estudio se ha realizado <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#44; no pueden extrapolarse sus resultados directamente para el tratamiento de las infecciones f&#250;ngicas en pacientes&#46; Las dificultades experimentales no han permitido estudiar los efectos fotodin&#225;micos sobre las hifas de <span class="elsevierStyleItalic">T&#46; mentagrophytes</span> ni sobre sus macroconidios&#44; ya que estos raramente son generados por el dermatofito cuando se cultiva en el laboratorio&#46; Sin embargo&#44; los resultados demuestran que el NMB es un FS a tener en cuenta para el tratamiento de las micosis cut&#225;neas causadas por este dermatofito&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Responsabilidades &#233;ticas</span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Protecci&#243;n de personas y animales</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que para esta investigaci&#243;n no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Confidencialidad de los datos</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este art&#237;culo no aparecen datos de pacientes&#46;</p></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Derecho a la privacidad y consentimiento informado</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este art&#237;culo no aparecen datos de pacientes&#46;</p></span></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Financiaci&#243;n</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este trabajo se ha realizado con la ayuda recibida del Ministerio de Econom&#237;a y Competitividad de Espa&#241;a &#40;CTQ2010-20870-C03-01 y CTQ2013-48767-C3-1-R&#41;&#46;</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Conflicto de intereses</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses</p></span></span>"
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Información del artículo
ISSN: 00017310
Idioma original: Español
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