Actas Dermosifiliogr., 1998;89:3-13

REVISIONES

Apoptosis. Revisión de mecanismos moleculares e implicaciones en Dermatología

PABLO F. PEÑAS

LUIS RÍOS

GUADALUPE F. BUEZO

AMARO GARCÍA-DÍEZ

Servicio de Dermatología. Hospital Universitario de la Princesa

Correspondencia:

PABLO F. PEÑAS. Servicio de Dermatología. Hospital Universitario de la Princesa. Diego de León, 62. 28006 Madrid.

Aceptado el 30 de septiembre de 1997.

Presentado parcialmente en la II Reunión de Biotecnología para el Dermatólogo Clínico. (Barcelona, enero de 1997).

Este trabajo ha sido financiado por el Fondo de Investigaciones de la Seguridad Social 96/2009.

ABREVIATURAS

cdk: cyclin-dependent kinases (quinasas dependientes de ciclina)

DD: death domain (dominio de muerte)

DNA-PK: DNA-dependent protein kinase (proteína quinasa dependiente del DNA)

FADD: Fas-associating protein with death domain (proteína con dominio de muerte asociada a Fas)

FasL: Fas ligand (Ligando de Fas)

ICE: Inteleukin 1b-converting enzyme (enzima convertidor de interleucina 1)

IFN: Interferon

MACH: caspasa-8

MORT1: FADD

mRNA: ácido ribonucleico mensajero.

PARP: poli(ADP-ribosa) polimerasa

PCNA: Proliferating cell nuclear antigen (antígeno nuclear de células en proliferación)

RIP: Receptor-interacting protein (proteína de interacción con receptor)

RUV: radiación ultravioleta

TNF-R1: Receptor de 55 kD de TNF

TNF: Tumor necrosis factor (factor de necrosis tumoral)

TRADD: TNFR1-associated death domain (dominio de muerte asociado al TNFR1)

TUNEL: TdT-mediated dUTP biotin nick end-labelling (marcaje de terminación de extremos con dUTP marcado con biotina mediado por TdT)

U1-70Kd: componente de 70 kD de la U1-ribonucleoproteína

Resumen.­La apoptosis es un complejo mecanismo que interviene en el desarrollo, el mantenimiento y la muerte de los organismos pluricelulares. Diversos estímulos desencadenan apoptosis actuando desde dentro (p53, ...) o fuera (Fas, TNF, ...) de las células. La mayor parte de los estímulos activan proteasas intracelulares (caspasas ...) que, actuando sobre el DNA y otras estructuras nucleares y citoplasmáticas, llevan a la destrución de la célula formando cuerpos apoptóticos. Estos restos celulares no desencadenan respuesta inflamatoria y son eliminados sin alterar el normal funcionamiento del organismo.

La apoptosis es parte del programa normal de diferenciación del queratinocito en la epidermis y en determinadas estructuras foliculares. Es también un mecanismo de respuesta habitual ante el daño causado por la luz ultravioleta en la epidermis o es desencadenado por linfocitos citotóxicos. Además, diversas enfermedades tanto neoplásicas como infecciosas o inflamatorias presentan alteraciones en el mecanismo de apoptosis.

Palabras clave: Apoptosis. Queratinocito.

INTRODUCCIÓN

No todas las muertes son accidentales. El mantenimiento de la homeostasis del organismo depende no sólo de la capacidad de renovación de los diversos tejidos mediante la producción de nuevos elementos celulares sino, también, de la capacidad de cada célula para autodestruirse cuando su presencia no es necesaria o se encuentra alterada (1-8). Este proceso se denomina apoptosis y se conoce también con el nombre de muerte celular programada cuando sucede en el proceso normal de diferenciación o desarrollo (4, 5, 9). La apoptosis es un proceso complejo en el cual determinados estímulos (intra o extracelulares) son capaces de activar un programa genético de suicidio celular (1, 7). Es esencial para numerosas funciones vitales y su alteración puede conducir a diferentes trastornos que van desde la letalidad embriológica a perturbaciones tisulares específicas en el desarrollo postnatal, pasando por incremento en la susceptibilidad para padecer determinados tipos de cáncer o enfermedades autoinmunes (1, 3, 6, 10). Por otra parte, algunos agentes medicamentosos modulan la regulación de la apoptosis y pueden proporcionar nuevas estrategias terapéuticas (1, 2, 6, 11).

Existen dos formas de muerte celular: apoptosis y necrosis (tabla I). La apoptosis es un proceso activo en el que la célula disminuye de tamaño se arruga se separa de sus células vecinas y parece hervir ya que continuamente está emitiendo prolongaciones a modo de burbujas que son inmediatamente reemplazadas por otras. Este proceso se denomina «zeiosis» (4, 7). Se observa condensación citoplásmica, marginación de la cromatina nuclear con fragmentación del DNA y, por último, la célula se rompe en numerosos fragmentos denominados cuerpos apoptóticos, manteniendo la integridad de la membrana, a pesar de las drásticas alteraciones bioquímicas que ocurren en su citoplasma (12). La célula apoptótica y sus fragmentos son reconocidos específicamente y aclarados por células vecinas o por macrófagos sin inducción de respuesta inflamatoria. La apoptosis es un proceso limpio, ordenado y extremadamente rápido que se desarrolla en unos pocos minutos u horas. Los cuerpos apoptóticos son eliminados con igual rapidez (3, 6). La otra forma de muerte celular es la necrosis. La célula rápidamente pierde su capacidad de mantener la homeostasis y se produce la rotura de la membrana citoplasmática. El contenido celular se vierte al exterior e induce una respuesta inflamatoria (3, 7). En determinadas condiciones «in vivo» puede existir una superposición entre necrosis y apoptosis: un estímulo puede inducir necrosis en una determinada porción de un tejido y apoptosis de las células adyacentes (5, 7).

Muchas o posiblemente todas las células son capaces de sintetizar proteínas que pueden ser utilizadas como armas para su propia destrucción (11). Mientras una célula es útil para el organismo la maquinaria letal se encuentra aletargada pero, cuando por alguna razón la célula se vuelve nociva para el mantenimiento de la homeostasis, el proceso de apoptosis se pone en marcha a través de estímulos externos o internos (2, 4, 7) (Fig. 1). Según cómo afecte al proceso de apoptosis la síntesis de proteínas y mRNA se distinguen varios tipos de mecanismos: inductores cuando es necesaria la síntesis para desencadenar el proceso; liberadores cuando es necesario inhibir las síntesis de proteínas y mRNA para desencadenar la apoptosis (la célula presenta inhibidores intracelulares que impiden la apoptosis); y de transducción cuando la activación o inhibición de la síntesis proteica o de mRNA no influyen en la apoptosis (el mecanismo de apoptosis está presente pero se regula por otros estímulos) (7). Se ha comprobado que en cada tipo celular predomina uno de estos mecanismos y que probablemente casi toda (o toda) la maquinaria de muerte celular está constitutivamente expresada en las células (3, 10). Estos procesos son de marcada complejidad y no del todo conocidos pero conllevan la activación de una familia de proteasas parecidas al enzima convertidor de la interleucina-1b (Interleukin-1b-converting enzyme-ICE) --actualmente denominadas capsasas (13)-- capaces de infringir daño celular diverso, fundamentalmente atacando elementos estructurales de la célula y activando a su vez endonucleasas. Estas proteasas producen la rotura del DNA en fragmentos de 180-200 pb o múltiplos de éstos, dando lugar a una imagen en escalera en el gel de agarosa, que es el marcador más importante del proceso de apoptosis (4). Los caminos que conducen a la activación del proceso de apoptosis son diferentes en los distintos tipos celulares, pero el mecanismo de muerte es el mismo, una vía final común (2, 3, 7).

FIG. 1. Esquema general del proceso de apoptosis.

Numerosos genes han sido identificados en los últimos años que tienen capacidad de regular la apoptosis (2). Muchos de nuestros conocimientos actuales sobre ellos derivan del estudio de la genética de un nematodo llamado Caenorhabditis elegans, que posee 1.090 células de las que exactamente 131 mueren durante el desarrollo (2, 3). Los genes del C. elegans mejor estudiados son: ced-3 y ced-4 que actuarían como inductores de la apoptosis mientras que el ced-9 actuaría suprimiendo ced-3 y ced-4. El ced-9 tiene homología estructural y funcional con la familia bc1-2, el ced-4 no tiene homología ni función conocida y el ced-3 codifica la familia de las cisteína proteasas (14).

TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA APOPTOSIS

Además de las puramente morfológicas (histología convencional y microscopía electrónica) se utilizan técnicas de inmunohistoquímica que demuestran la fragmentación del DNA nuclear en las células y tejidos (TUNEL o TdT-mediated dUTP biotin nick end-labelling), técnicas bioquímicas que demuestran el daño específico del DNA (la electroforesis en gel de agarosa) o la valoración de la actividad proteolítica nudear entre otras (12).

INDUCTORES DE APOPTOSIS

Los mecanismos que inducen la apoptosis son múltiples, complejos y no del todo conocidos. Los mejor estudiados son (Figs. 2 y 3): 1) Por estimulación de receptores de membrana. 2) Por granzimas. 3) Por daño estructural infringido al DNA. 4) Por ausencia de factores de crecimiento.

FIG. 2. Mecanismos celulares de desencadenimiento de apoptosis: vías de activación de Fas, TNFR, y perforinas-granzimas. Ver el texto para detalles.

FIG. 3. Mecanismos celulares de desencademiento de apoptosis:vía de p53. Ver el texto para detalles.

Por estimulación de receptores (unión a ligandos)

Los receptores mejor conocidos que son capaces de inducir apoptosis son: el Fas y el receptor del factor necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor-TNF).

Fas

Fas (CD95) es una molécula transmembrana de 325 aminoácidos perteneciente a la familia de los receptores de TNF y de crecimiento nervioso (Nerve gowth fctor-NGF), familia que incluye otros conocidos miembros como el CD40, CD27 o CD30. La región extracelular de todos ellos consiste en tres a seis dominios ricos en cisteína (10). El Fas y el receptor de 55 kD de TNF (TNFR1) poseen una región en su porción citoplasmática de 60-70 aminoácidos que es necesaria y suficiente para la transducción de la señal apoptótica y por ello se le denomina dominio de muerte (death domain-DD)(2, 10, 15).

La expresión del Fas en tejidos muestra considerable variabilidad y muchos tejidos expresan pequeñas cantidades de Fas (10), pero es ampliamente expresado en linfocitos maduros activados y su expresión puede estimularse por interferón-* (IFN-*) o por una combinación de IFN-* y TNF-* (10). En 1994 autores japoneses (16, 17) demostraron que los queratinocitos en cultivo expresan Fas (Fig. 4) y esta expresión aumenta cuando se estimulan con IFN-*.

FIG. 4. Citometría de flujo de queratinocitos humanos en cultivo. Se observa la expresión de Fas en los queratinocitos en reposo. X63: control negativo.

E1 ligando para el Fas o FasL es una proteína de membrana con un peso molecular de 40.000. Se expresa en linfocitos T activados y su expresión se induce por el PMA y se inhibe por la ciclosporina A (10). Una forma soluble de FasL se ha encontrado en los sobrenadantes de linfocitos T activados (18).

La señalización a través del Fas conduce a apoptosis (14) (Fig. 2). La puesta en marcha del proceso requiere la unión del Fas a anticuerpos anti-Fas, a células que expresan FasL o a FasL soluble (10). Esta unión activa la adhesión a través del DD de otras proteínas intracelulares que también poseen el DD (15). A Fas se le unen MORT1 (o FADD -Fas-associating protein with death domain) y RIP (receptor-interacting protein). Posteriormente al complejo Fas/FADD se le une MACH, produciéndose su activación. MACH es una enzima proteolítica de la familia de las caspasas (caspasa-8) capaz de desencadenar la apoptosis (14, 19, 20).

TNFR1

La unión de ligandos a través del TNFR1 (CD120a) también induce apoptosis a través de DD, de una manera similar a la unión de ligandos con Fas (2, 10); pero las vías parecen distintas. De hecho, la muerte celular inducida por Fas es más rápida que la inducida por TNFR1 (10, 21), quizás en parte por la habilidad de TNF de inducir el factor de transcripción NF-*B que posee una gran capacidad antiapoptótica (22)

A1 TNFR1 se le unen TRADD (TNFR1-associated death domain) y RIP mediante DD (Fig. 2). A TRADD también son capaces de unirse FADD, produciéndose la convergencia en los caminos de la muerte entre el Fas y TNFR1. Por último, al complejo TNFR1/ TRADD/FADD se le une MACH (14, 20).

Granzimas

La citotoxicidad mediada por linfocitos T se divide en procesos dependientes (perforinas-granzimas) e independientes (Fas-FasL) de Ca2+ (10). En el primero, perforinas y granzimas son liberadas por el linfocito T citotóxico (Fig. 2). Las perforinas provocan poros en la célula diana (23) por la que penetran las granzimas (5). La granzima B tiene una actividad serina-proteasa y un comportamiento similar a las caspasas (3), y es capaz de activar la CPP32b (14) desencadenando la apoptosis.

Daño al DNA

E1 organismo posee diversos mecanismos para protegerse del daño infringido al DNA. E1 más importante es el mediado por la fosfoproteína p53 (Fig. 3). Esta proteína es el producto de un gen supresor tumoral cuya inactivación es la lesión genética conocida más común en el cáncer humano (24). Participa en la respuesta celular a la radiación ionizante y a otros agentes que dañan el DNA (25). Si las células se exponen a la radiación ionizante, los niveles intracelulares de p53 se elevan y el ciclo celular se detiene de manera transitoria al final de la fase G1 para permitir que la célula o bien repare el DNA dañado o bien entre en apoptosis si el daño es demasiado grande (2). Parece que la decisión final dependerá de otros factores apoptóticos y anti-apoptóticos dentro de la célula (25). Este sistema actúa impidiendo la propagación de daño en el DNA de unas células a sus hijas. Por esta razón la p53 ha sido referida como el guardián del genoma (2, 8).

El mecanismo por el cual la p53 conduce a una detención del ciclo celular puede ser atribuido a su papel como factor de transcripción y parece ser el siguiente (2): Un aumento de la p53 inducido por la radiación conduce a la síntesis de una serie de proteínas incluyendo la p21WAF1/CIP1 GADD45 y Mdm2. La p21 WAF1/CIP1 actúa como un potente inhibidor de las cinasas dependientes de ciclina (cyclin-dependent kinases, cdk), conduciendo a una alteración en la fosforilización de la pRb con subsiguiente detención del ciclo celular en el paso entre G1 y S (8) y también formando un complejo con PCNA (proliferating cell nuclear antigen) que inhibe la actividad DNA polimerasa (25). La inducción de GADD45 también frena la progresión del cido celular al unirse a PCNA (25). En contraste con p21WAFl/CIP1 y con el GADD45 la expresión Mdm2 parece inactivar tanto la p53 como la pRb permitiendo la liberación del bloqueo celular. Además de frenar el cido celula la p53 tiene también un efecto directo sobre la apoptosis porque es capaz de regular la expresión de Bc1-2 y Bax (2).

Para entender el efecto de la pRB sobre el ciclo celular es conveniente conocer el efecto de las diversas ciclinas (proteínas de ciclo celular) y de las cdk sobre el ciclo celular (revisado por Sherr (26)). En resumen, la pRB no fosforilada secuestra diversos factores de transcripción e impide el paso a la fase S del ciclo celular. La fosforilación de la pRB por diversas cdk libera los factores de transcripción y el ciclo celular continua (8). Un bloqueo de las cdk permite que la pRB persista sin fosforilar y el ciclo celular no pase a fase S.

La p53 no se expresa en condiciones normales ni en queratinocitos ni en melanocitos ni en fibroblastos de piel sana (27). Tras estímulo con radiación ultravioleta (RUV) se pudo detectar p53 en queratinocitos, pero no se observó presencia de Mdm2 (28).

Retirada de factores de crecimiento

Los factores de crecimiento regulan los niveles de las proteínas de la familia Bcl-2 probablemente a través de las vías de Ras y de la fosfatidilinositol 3-quinasa (21).

REGULACIÓN INTRACELULAR DE LA APOPTOSIS

Ha sido recientemente revisada de manera amplia por Hale et al. (2), pero nos detendremos en unos cuantos puntos importantes

Familia ICE o caspasas

Constituyen un grupo de proteasas citoplásmicas que están estructuralmente relacionadas con productos del gen ced-3 en el C. elegans y con el enzima humano convertidor de la interleucina-lb (Interleukin-1b-converting enzyme-ICE). La ICE divide el enlace asp-x (donde x es cualquier aminoácido) y transforma el precursor inactivo de la interleucina 1b de 31 kD (pro-IL-1b) en su forma activa de 17,5 kD (2). Además de la ICE se están describiendo nuevos miembros (14) denominándose en conjunto caspasas (13) (Fig.5). De ellas ICE y CPP32b han sido las mejor estudiadas. Estas proteasas tienen un papel esencial en la apoptosis, presumiblemente a través de su acción proteolítica sobre determinadas estructuras, incluyendo los miembros de su misma familia.

FIG. 5. Familia de las capsasas y substratos sobre los que actúan.

La ICE (caspasa-1) además de convertir la pro-IL-1ben IL-1bes capaz de autoactivarse a sí misma por autorrotura, activar otras caspasas como la CPP32b(25) y podría tener otras acciones (2). La CPP32b o Yama (caspasa-3) inactiva la enzima poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), el componente de 70 kD de la U1ribonucleoproteína (U1-70 kD) y la proteína quinasa DNA-dependiente (DNA-PK) proteínas involucradas en la reparación del DNA y en el mantenimiento de la integridad genómica (29). La pérdida de función de la PARP activa las endonucleasas dependientes de Ca2+/Mg2+ involucradas en la rotura del DNA internudeosómico (2). La MACH, FLICE o Mch5 (caspasa-8), que parece ser el punto de convergencia de las vías de apoptosis de Fas y TNFR1, actúa proteolíticamente sobre otras caspasas activándolas (como las caspasa-1 y 3) y sobre PARP inactivándola (20).

Otras caspasas menos estudiadas actúan sobre otras proteínas nucleares como láminas (29) sobre proteínas citoplasmáticas como la protein-cinasas C (14) y sobre componentes del citoesqueleto como la actina (25).

Otras proteasas no pertenecientes a las caspasas han sido implicadas en apoptosis como son: la catepsina B y D, la colagenasa, serina y cisteína proteasas, etc. (2).

Proteínas relacionadas con Ced-9

El gen bc1-2, homólogo al ced-9 del C. elegans, codifica la proteína Bcl-2 que es un potente inhibidor de la apoptosis por diversos mecanismos (2). Se ha identificado una familia multigénica de proteínas relacionadas con el Bcl-2 cuyos diferentes miembros exhiben un espectro de actividad que va desde la supervivencia celular a la muerte. Asimismo se han identificado proteínas virales con homología con la familia Bcl-2. La manera en que Bcl-2 inhibe la apoptosis es desconocida, pero se han propuesto varios mecanismos: controlando la liberación de Ca2+ de mitocondrias y retículo endoplásmico, debido a un efecto antioxidante o impidiendo el transporte al núcleo de proteínas (30).

Los miembros pertenecientes a esta familia pueden dividirse en dos categorías: una, que inhibe la apoptosis y que incluiría Bcl-2 Bcl-XL, Mcl-1, la proteína E1B 19K de adenovirus y la BHRF1 del virus de Epstein Barr y otra segunda, capaz de inducir apoptosis que incluye Bax, Bak, NbK/BlK1, Bad y Bd-XS (2). Los miembros de ambas categorías interaccionan entre sí y es la proporción entre inductores e inhibidores de la familia uno de los hechos que determinan que una célula entre o no en apoptosis. Así, por ejemplo, la proteína Bcl-2 y Bcl-XL dimerizan con Bax y limitan su efecto antiapoptótico o bien Bad puede ligarse a Bcl-2 y a Bcl-XL y limitar su efecto sobre el Bax. Se ha propuesto que el balance Bcl-2/Bax es un importante regulador de la susceptibilidad a la apoptosis (2).

La epidermis normal expresa Bcl-2 en la capa basal, aunque parece que su capacidad antiapoptótica no es muy eficaz (31).

Otros

Otros genes con papeles establecidos en la regulación de la proliferación y diferenciación son también importantes a la hora de controlar la apoptosis. Muchas moléculas pueden influir en la decisión de inducir o inhibir la apoptosis mediando su actividad a través de receptores asociados con diversos efectos. Por ejemplo, las citocinas regulan la apoptosis actuando a través de receptores con actividad tirosina-quinasa (familias Src y Jak) (2). Moléculas que activan las vías de Ras y otras GTPasas o la vía de la proteína cinasa C o estímulos que producen síntesis o liberación de AMPc, ceramidas o radicales libres han sido implicados con efecto diverso en apoptosis (2). Diversos genes promotores de tumores influyen en la muerte celular. Genes como c-myc, ras, fos, jun, y los factores de transcripción a los que dan lugar, regulan la apoptosis a diversos niveles, observación consistente con la importancia que un defecto en la apoptosis puede tener en el desarrollo del cáncer (2, 30). Diversas proteínas virales interaccionan con las proteínas celulares que restringen el crecimiento celular (como p53 o pRB) de las células hospedadoras para así poder replicar el DNA viral (2).

CONSECUENCIAS CELULARES DE LA APOPTOSIS

Durante la apoptosis la cromatina se fragmenta y se condensa, las organelas y la célula se encogen y contraen y la membrana citoplasmática forma vesiculas conduciendo a la aparición de cuerpos apoptóticos (2).

Cambios nucleares

La cromatina se condensa y la envoltura nuclear se rompe debido a la destrucción de las láminas nucleares. Las láminas son filamentos intermedios asociados a la parte interna de la envoltura nuclear que organizan el núcleoesqueleto y proporcionan la estructura para la unión de la cromatina a la envoltura nuclear. Las láminas se unen a sitios específicos del DNA que se encuentran regularmente espaciados en la cromatina a intervalos de 20-50 kb. La degradación de las láminas por la proteasa de lámina, LamP, libera los sitios de anclaje en el DNA y los hace accesibles a las endonucleasas (2, 25). Las endonucleasas responsables son principalmente la DNAasa II, Nuc 18 y Nuc 1, que fragmentan el DNA entre los nucleosomas. Se obtiene así la imagen en escalera de fragmentos de DNA múltiplos de 180-200 pb (tamaño del oligonucleosoma), que es el marcador bioquímico de la apoptosis (2).

Otras estructuras diana para los enzimas proteolíticos incluyen la NuMa (proteína del aparato nuclear mitótico) (25), la U1-70Kd, la PARP y la DNA-PK (29).

Cambios citoplásmicos

El cambio morfológico más llamativo durante la apoptosis es la fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos, lo que sugiere la gran importancia de la reestructuración y destrucción de la red de microtúbulos (2, 25). La apoptosis conlleva un aumento en los niveles de transglutaminasas de tipo II, cuya función parece ser la de unir irreversiblemente las proteínas citoplasmáticas. Esto impide la salida al medio extracelular de sustancias que podrían provocar una respuesta inflamatoria (2). Las mitocondrias podrían colaborar generando radicales superóxido y liberando otras moléculas (32).

Cambios en la membrana

Las alteraciones de la membrana conducen a la separación de la célula de sus vecinas y/o de la matriz extracelular y a la expresión de marcadores de superficie que permiten un rápido reconocimiento y eliminación de los cuerpos apoptóticos por las células fagocitadoras (2). Tres mecanismos han sido implicados en el reconocimiento de la célula apoptótica por el macrófago: la pérdida de residuos de ácido siálico en las glucoproteínas de membrana, que es reconocida por pectinas de la membrana del macrófago; la exposición de fosfatidil serina en la membrana celular reconocida por la anexina V lipocortinal y otros receptores de fosfatidilserina y la expresión de un ligando para trombospondina, que a su vez es reconocida por los receptores para trombospondina *Vb3 y CD36 del macrófago (2, 33). No obstante muchos otros mecanismos pueden estar imbricados y algunos incluso pueden ser específicos de cada célula.

IMPLICACIONES EN DERMATOLOGÍA

Numerosos trabajos confirman la importancia que ha adquirido la apoptosis en los últimos años (34). La palabra apoptosis aparece en 1.583 trabajos de la base de datos MEDLINE de 1994, 2.584 de 1995 y en 3.233 de 1996. Desde el punto de vista dermatológico las mayores implicaciones son:

Fisiología

Importancia en la fisiología epidérmica

Mediante análisis bioquímicos y ultraestructurales se ha establecido que la apoptosis es parte del programa normal de diferenciación del queratinocito en la epidermis y en determinadas estructuras foliculares (4, 5, 9). Los estímulos que inducen la apoptosis en el queratinocito epidérmico no se conocen con exactitud, pero probablemente incluyan la supresión de factores de crecimiento (5) y la desaparición de la expresión de Bcl-2 en capas suprabasales (4), entre otros. En el epitelio folicular (5, 31), la expresión de Bcl-2 se correlaciona con la protección frente a la apoptosis en el ciclo del pelo: mientras los niveles de Bcl-2 se mantienen durante el catagén y telogén en la papila, descienden en el bulbo y vaina epitelial externa. La papila dérmica queda protegida de la apoptosis por el Bcl-2.

Citotoxicidad

Dos son los mecanismos fundamentalmente implicados en la citotoxicidad mediada por lifocitos T: el de perforinas-granzimas (dependiente de Ca2+) y el de Fas-FasL (independente de Ca2+) (10, 23). Este segundo activa los mecanismos de apoptosis de la célula diana tal como hemos visto. Por otro lado, las perforinas liberadas por el linfocito citotóxico producen poros en la membrana de la célula diana provocando su lisis y muerte. Sin embargo, se ha encontrado que las granzimas, proteínas liberadas en conjunto con las perforinas y que penetran dentro de la célula diana por los poros provocados éstas (23), son capaces de activar las caspasas e inducir también apoptosis (5).

Eliminación de linfocitos autorreactivos

La regulación fisiológica de la muerte celular es esencial para la eliminación de los linfocitos potencialmente autorreactivos (6) y de aquellos que ya han intervenido en la respuesta inmune (35). La estimulación del linfocito T a través de su receptor antigénico (TCR) induce la síntesis de Fas, que inicialmente no es activo, y de FasL. Después de unos días la molécula Fas se activa y puede ligarse al FasL sobre la misma célula o sobre otra célula y desencadenar la activación de la cadena de caspasas y la apoptosis. Los linfocitos una vez activados tienen, por lo tanto, un período de tiempo para cumplir su misión --responder al antígeno-- que es el período en el cual el Fas se encuentra inactivo. Una vez cumplida su misión las células se suicidan (10, 35).

Apoptosis inducida por luz ultravioleta

Una de las consecuencias de la exposición aguda a la RUV es la aparición de las llamadas sunburn cells o células postquemadura solar en la epidermis (36). Utilizando únicamente criterios morfológicos hace ya tiempo que se interpretaba la célula postquemadura solar como un queratinocito que ha sufrido apoptosis; esto se ha demostrado con técnicas específicas. El mecanismo, aunque pobremente conocido, parece al menos ligado a la síntesis de TNF-* y la inducción de TNFR1 (36), a la inducción de la expresión de Fas y FasL (37) y a la aparición de p53 (38), ocurriendo todos estos procesos en el queratinocito.

Patología

Se han involucrado numerosos procesos en los cuales la apoptosis es uno de los mecanismos implicados (16, 17). Entre ellos se encuentran el exantema fijo, enfermedades virales, el eritema exudativo multiforme y la necrólisis epidérmica tóxica, erupciones liquenoides, enfermedad injerto contra hospedador, vitíligo y patología tumoral. Muy recientemente se ha encontrado en la esclerodermia que las células endoteliales entran en apoptosis en las fases iniciales de la enfermedad en humanos (39).

Alopecia areata

Se ha observado signos de apoptosis en la papila dérmica de la alopecia areata por TUNEL a pesar de expresar Bcl-2 (31)

Enfermedades virales

Con objeto de evitar que una célula parasitada por un virus sufra un proceso de apoptosis y muera, lo que podría conllevar la muerte del virus, algunos virus poseen mecanismos para inhibirla. Así, por ejemplo, el virus de Epstein Barr produce la proteína BHRF1, que se parece al Bcl-2 y actúa como ella y la LMP-1 que estimula la síntesis de Bcl-2 (1). Las proteínas E6 y E7 de los papilomavirus inactivan la p53 y la pRb (40). Los poxvirus elaboran la proteína CrmA, que es capaz de inhibir a las caspasas (14, 32).

Enfermedad injerto contra hospedador

Aunque algunos datos experimentales sugieren que las lesiones más precoces pueden preceder a la infiltración por células efectoras, hoy se conoce cómo la alteración del queratinocito en este proceso es principalmente debida a la apoptosis mediada por perforinas-granzimas, TNF o Fas (41). La demostración se ha realizado también en humanos (42).

Eritema exudativo multiforme y necrólisis

epidérmica tóxica

Se ha demostrado tanto por microscopía electrónica, como por TUNEL y por análisis del DNA en gel de agarosa la existencia de apoptosis en la necrólisis epidérmica tóxica (43). Su mecanismo íntimo no es conocido, pero están implicados linfocitos citotóxicos frente al queratinocito, que son capaces de liberar citocinas tales como el TNF (43) y podrían expresar FasL que se uniría al Fas expresado por el queratinocito (Fig. 6) (16).

FIG. 6. Expresión de Fas en epidermis de una lesión de eritema exudativo multiforme.

Liquen plano

Aunque se ha comprobado por estudios morfológicos (principalmente microscopía electrónica) que los llamados cuerpos de Civatte, cuerpos coloides y células disqueratóticas corresponden a células apoptóticas (4, 44), nuestro grupo ha demostrado la presencia de apoptosis en el liquen plano mediante la técnica bioquímica del TUNEL (Fig. 7). Probablemente la presencia de Fas en epidermis de liquen plano esté implicada en el procesco (Fig. 8) (16, 17).

FIG. 7. Células apoptóticas en epidermis de una lesión de liquen plano. Se utilizó la técnica de TUNEL, revelado con inmunofluorescencia, para demostrar la apoptosis de los queratinocitos.

FIG. 8. Expresión de Fas en epidermis de liquen plano.

Lupus eritematoso sistémico

Dos mutantes espontáneos en el ratón denominados lpr (lymphoproliferation) y gld (generalized lymphoproliferative disease) presentan un cuadro de enfermedad autoinmune semejante al lupus eritematoso con producción de grandes cantidades de inmunoglobulinas y autoanticuerpos (6). Estos ratones poseen una mutación para el Fas y el FasL, respectivamente, que ha inutilizado esta vía de apoptosis (10). Cheng et al. (45) han detectado niveles elevados de Fas soluble --al que falta el dominio trasmembranoso-- en el suero de algunos enfermos con lupus eritematoso sistémico. E1 descenso de la apoptosis mediada por Fas puede contribuir a la acumulación de células autoinmunes en la enfermedad. Además se ha descrito una enfermedad parecida al lupus en ratones transgénicos que constitutivamente sobreexpresan Bcl-2 en sus células B (6).

Patología tumoral

La inhibición de los mecanismos de apoptosis desempeña un papel básico en la génesis del cáncer cutáneo. La radiación solar actúa como verdadero iniciador y promotor de éste. Para evitar su aparición la epidermis induce la expresión de p53 tras la exposición a RUV, que a su vez induce p21 que inhibiendo las cdk detiene el ciclo celular y permite que se reparen las alteraciones genómicas inducidas por RUV (27).

Sin embargo, la RUV y fundamentalmente la UVB, genera dímeros de ciclobutano en diversos genes incluido el gen p53 (27). Si este queratinocito defectuoso es expuesto nueva y reiteradamente a la radiación solar, la p53 se induce y se puede producir su apoptosis; pero dado su defecto cabe la posibilidad de que exprese una p53 mutada que no induce p21 y que no es capaz de detener el ciclo celular (46). Si esta célula sobrevive y se divide va a dar lugar a un pequeño clon de queratinocitos parcialmente defectuosos. En ausencia de RUV probablemente estas células involucionen por mecanismos aún desconocidos. Sin embargo, exposiciones adicionales pueden eventualmente mutar nuevamente la p53 y otros genes y provocar mayores alteraciones que originarían aneuploidía y otras alteraciones que se traducen clínicamente como queratosis actínica y carcinoma espinocelular (27). De esta manera se explica la presencia de elevados niveles de p53 junto a Ki-67 en tumores como el carcinoma espinocelular (47), que corresponde a formas mutadas de p53 incapaces de actuar sobre el ciclo celular en células con alta actividad mitótica. Sin embargo, los estudios basados en inmunohistoquímica no son capaces de diferenciar p53 nativa de la p53 mutada, con lo que los hallazgos son variables entre los diversos trabajos y las neoplasias estudiadas (40, 47-50).

Ciertas células normales expresan niveles altos de Bcl-2 que las preserva de sufrir apoptosis, especialmente aquellas cuya destrucción tendría efectos nocivos para el organismo. Los tumores que derivan de estas células son más resistentes y tienen habitualmente un curso más agresivo. Ocurre esto con los melanocitos, cuya misión principal es proteger al resto de las células de la piel de la radiación solar y cuya desaparición facilita un daño intenso en las estructuras cutáneas. Los melanocitos expresan niveles aumentados de Bcl-2 y cuando son dañados genéticamente son más resistentes a la apoptosis y dan lugar a tumores que tienen un curso más agresivo y son menos sensibles a los efectos de quimioterapia o radioterapia (5). Sin embargo, la Bcl-2 se encuentra aumentada también en carcinomas basocelulares (51), tumores que son muy sensibles a la radioterapia, de lo cual se deduce que los mecanismos que regulan la apoptosis deben ser todavía más complejos de lo que conocemos hasta hoy. Los niveles aumentados de Bcl-2 en carcinomas basocelulares podría indicar que la ausencia de apoptosis y no el aumento de proliferación celular es lo que constituye un importante factor en la expresión tumoral.

La sobreexpresión de ciclina D1 ha sido implicada en el histiocitoma fibroso maligno y en el carcinoma espinocelular (52). Esta ciclina tiene un efecto similar a la p53 mutada, esto es, permite la activación de cdk y la continuación del ciclo celular.

Abstract.­Apoptosis is a complex mechanism involved in the development, homeostasis and death of pluricellular organisms. Several stimuli induce apoptosis acting from inside (p53...) or outside (Fas, TNF...) of cells. Most of these stimuli activate intracellular proteases (caspases...) that acting on DNA and other nuclear and cytoplasmic structures lead to the destruction of the cell forming apoptotic bodies. These cellular debris do not induce inflammation and are eliminated without disturbing the normal function of the organism.

Apoptosis is part of the normal differentiation programm of the keratinocyte in the epidermis and the follicle. It is the mechanism of normal response to the damage caused by ultraviolet radiation in the epidermis or the way to destroy targets by cytotoxic lymphocytes. Moreover diseases of neoplastic,

infectious or inflammatory origin present with alterations in the normal mechanism of apoptosis.

Peñas PF, Ríos L, Buezo GF, García-Díez A. Apoptosis. Review of molecular mechanisms and implications in Dermatology. Actas Dermosifiliogr 1998;89:3-13.

Key words: Apoptosis. Keratinocyte.

BIBLIOGRAFÍA

1. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 1995;267:1456-62.

2. Hale AJ, Smith CA, Sutherland LC et al. Apoptosis: molecular regulation of cell death. Eur J Biochem 1996;236:1-26.

3. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 1995;267:1445-9.

4. Haake AR, Polakowska RR. Cell death by apoptosis in epidermal biology. J Invest Dermatol 1993;101:107-12.

5. Norris DA. Differential control of cell death in the skin. Arch Dermatol 1995;131:945-8.

6. Orrenius S. Apoptosis: molecular mechanisms and implications for human disease. J Int Med 1995;237:529-36.

7. Cohen JJ. Apoptosis. Immunol Today 1993;14:126-30.

8. Meikrantz W, Schlegel R. Apoptosis and the cell cycle. J Cell Bioch 1995;58:160-74.

9. McCall CA, Cohen J. Programmed cell death in terminally dlifferentiating keratinocytes: role of endogenous endonudease. J Invest Dermatol 1991;97:111-4.

10. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science 1995;267:1449-56.

11. Duke RC, Ojcius DM, Young JD-E. Cell suicide in health and disease. Sci Am 1996;:48-55.

12. Ramachandra S, Studzinski GP. Morphological and biochemical criteria of apoptosis. En: Studzinski GP ed. Cell growth and apoptosis. A practical aproach. Oxford: IRL. Press 1995:

13. Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW et al. Human ICE/CED-3 protease nomendature. Cell 1996;87:171.

14. Fraser A, Evan G. A license to kill. Cell 1996;85:781-4.

15. Huang B, Eberstadt M, Olejniczak ET, Meadows RP, Pesik SW. NMR structure and mutagenesis of the Fas (APO- 1/CD95) death domain. Nature 1996;384:638-41.

16. Sayama K, Yonehara S, Watanabe Y, Miki Y. Expression of Fas antigen on keratinocytes in vivo and induction of apoptosis in cultured keratinocytes. J Invest Dermatol 1994;103:330-4.

17. Oishi M, Maeda K, Sugiyama S. Distribution of apoptosis-mediating Fas antigen in human skin and effects of anti-Fas monoclonal antibody on human epidermal keratinocyte and squamous cell carcinoma cell lines. Arch Dermatol Res 1994;286:396-407.

18. Tanaka M, Suda T, Takahashi T, Nagata S. Expression of the functional soluble form of human Fas ligand in activated lymphocytes. EMBO J 1995;14:1.129-35.

19. Enari M, Talanian RV, Wong WW, Nagata S. Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis. Nature 1996;380:723-6.

20. Boldin MP, Goncharov, TM Goltsev, YV Wallach D. Involvement of MACH a novel MORT1/FAAD-interacting protease; in FAS/APO-1 and TNF receptor-induced cell death. Cell 1996;85:803-15.

21. Cleveland JL, Ihle JL. Contenders in FasL/TNF death signaling. Cell 1995;81:479-82.

22. Barinaga M. Life-death balance within the cell. Science 1996;274:724.

23. Berke G. The CTL''s kiss of death. Cell 1995;81:9-12.

24. Harris CC. p53: at the crossroads of molecular carcinogenesis and molecular epidemiology. J Invest Dermatol Symp Proc 1996;1:115-8.

25. Ashkenas J, Werb Z. Proteolysis and the biochemistry of life-or-death decisions. J Exp Med 1996;183:1947-51.

26. Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins. Cell 1993;73:1059-65.

27. Brash DE, Ziegler A, Jonason AS, Simon JA, Kunala S, Leffell DJ. Sunlight and sunburn in human skin cancer: p53 apoptosis and tumor promotion. J Invest Dermatol Symp Proc 1996;1:136-42.

28. Burden AD, Stables GI, Campbell I, Thomson W, MacKie RM. Mdm-2 is not induced by p53 in human keratinocytes in vivo. J Cutan Pathol 1996;23:25-9.

29. Casciola-Rosen L, Nicholson DW, Chong T et al. Apopain/CPP32 cleaves proteins that are essential for cellular repair: a fundamental principle of apoptotic death. J Exp Med 1996;183:1957-64.

30. King KL, Cidlowski JA. Cell cycle and apoptosis: common pathways to life and death. J Cell Bioch 1995;58:175-80.

31. Norris DA, Duke R, Whang K, Middleton M. Immunologic cytotoxicity in alopecia areata: apoptosis of dermal papilla cells in alopecia areata. J Invest Dermatol 1995;104:8-9.

32. Henkart PA, Grinstein S. Apoptosis: mitocondria resurrected? J Exp Med 1996;183:1293-5.

33. Savill J, Fadok V, Henson P, Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis. Immunol Today 1993;14:131-6.

34. Cohen N. Exponential growth in apoptosis. Immunol Today 1995;16:346-8.

35. Strasser A. Death of a T cell. Nature 1995;373:385-6.

36. Schwarz A, Bhardwaj R, Aragane Y et al. Ultraviolet-B-induced apoptosis of keratinocytes: evidence for partial involvement of tumor necrosis factor-* in the formation of sunburn cells. J Invest Dermatol 1995;104:922-7.

37. Leverkus M, Yaar M, Gilchrest BA. Evidence for W-induced autocrine Fas/Fas ligand-mediated keratinocyte apoptosis. J Invest Dermatol 1996;10 6:827.

38. Barnadas MA, Colomo L, Curell R, Moragas JMD. Expression of the p53 protein in sun-damaged skin. Acta Derm Venereol (Stockh) 1996;76:203-4.

39. Sgonc R, Gruschwitz MS, Dietrich H, Recheis H, Gershwin ME, Wick G. Endothelial cell apoptosis is a primary pathogenetic event underlying skin lesions in avian and human scleroderma. J Clin Invest 1996;98:785-92.

40. Khorshid SM, Glover MT, Churchill L, McGregor JM, Proby CM. p53 immunoreactivity in non-melanoma skin cancer from immunosuppressed and immunocompetent individuals: a comparative study of 246 tumours. J Cutan Pathol 1996;23:229-33.

41. Gilliam AC, Whitaker-Menezes D, Korngold R, Murphy GF. Apoptosis is the predominant form of epithelial target cell injury in acute experimental graftversus-host disease. J Invest Dermatol 1996;107:377-83.

42. Langley RGB, Walsh N, Nevill T, Tomas L, Rowden G. Apoptosis is the mode of keratinocyte death in cutaneous graft-versus-host-disease. J Am Acad Dermatol 1996;35:187-90.

43. Paul C, Wolkesnstein P, Adle H et al. Apoptosis as a mechanism of keratinocyte death in toxic epidermal necrolysis. Br J Dermatol 1996;134:710-4.

44. Weedon D. Apoptosis. Adv Dermatol 1990;5:243-56.

45. Cheng J, Zhou T, Liu C et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science 1994;263:1759-62.

46. Hunter T. Braking the cycle. Cell 1993;75:839-41.

47. Mansoor A, McKee PH, Simpson JA, McGuire B, Hobbs C. Prognostic significance of Ki-67 and p53 immunoreactivity in cutaneous squamous cell carcinomas. Am J Dermatopa-thol 1996;18:351-7.

48. Matsumura T, Yoshihama Y, Kimura T, Shintani S, Alcalde RE. p53 and MDM2 expression in oral squamous cell carcinoma. Oncology 1996;53:308-12.

49. Kennedy MM, Blessing K, King G, Kerr KM. Expression of bc1-2 and p53 in Merkel cell carcinoma. Am J Dermatopathol 1996;18:273-7.

50. Bergman R, Ramon M, Kilim S, Lichtig C, Friedman-Birnbaum R. An immunohistochemical study of p53 protein expression in classical Kaposi''s sarcoma. Am J Dermatopa-thol 1996;18:367-70.

51. Morales-Ducret CRJ, van de Rijn M, LeBrun DP, Smoller BR. bcl-2 expression in primary malignacies of the skin. Arch Dermatol 1995;131:909-12.

52. Inohara S, Kitagawa K, Kitano Y. Expression of cyclin D1 and p53 protein in various malignant skin tumors. Dermatology 1996;192:194-8.