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FIG. 1. --Esquema de integrinas ß1. Cuando las integrinas ß1 adquieren la conformación activa exponen epítopos de activación en su superficie que pueden ser detectados con anticuerpos monoclonales. En esta situación se pueden unir a ligandos extracelulares (por ejemplo, colágeno) y además se unen a las proteínas intracelulares (talina, vinculina) que median la unión al citoesqueleto de actina.
FIG. 2. --Localización de integrinas ß1 en toda la superficie del queratinocito (A-D), mientras que la conformación activa sólo está presente en los contactos focales (E y F). Mediante microscopia de inmunofluorescencia digital confocal determinamos que la conformación activa de las integrinas ß1 se sitúa principalmente en los contactos focales. Para cada campo se cogían cuatro secciones ópticas desde la unión a la matriz extracelular separadas 0,5 µm. Sólo se muestran dos secciones con HUTS-21 debido a la ausencia de fluorescencia en el resto.
FIG. 3. --El manganeso estimular la adhesión de queratinocitos a colágeno y fibronectina mediante las integrinas ß1. Este efecto se demuestra por la parcial inhibición del efecto que se consigue usando un anticuerpo monoclonal (VJ1/14), que es un potente inhibidor de la actividad de las integrinas ß1. El anticuerpo activador TS2/16 utilizó como control positivo. Se muestra un experimento representativo realizado en triplicado. Los datos se dan como porcentaje de absorvancia con respecto al control.
FIG. 4. --Disminución en la expresión de integrinas ß1 en conformación activa en la psoriasis comparada con la piel sana. Los estudios de inmunohistoquímica mostraron que en piel psoriásica exitía una expresión suprabasal de integrinas ß1. Tanto estas integrinas como las situadas en caras laterales y apicales de los queratinocitos basales de piel psoriásica se encuentran en conformación inactiva. Sin embargo, en piel sana existía tinción de integrinas ß1 en conformación activa en caras laterales y apicales de los queratinocitos basales. Barra de escala: 50 um.
FIG. 5. --Las tetraspaninas se acumulan en las uniones intercelulares. En medios con calcio bajo ( < 0,1 mM) las uniones intercelulares se relajan por ausencia de la actividad de las cadherinas y se observa que en los filopodios que unen las células se acumulan tanto integrinas a3ß1 como tetraspaninas CD9 y CD81. Barra de escala: 30 µm.
FIG. 6. --Las tetraspaninas se expresan en piel normal. CD9, CD81 y CD151 tiñen las capas basal y espinosa mientras que las integrinas ß1 sólo tiñe la capa basal. Ambos grupos de moléculas se localizan en uniones intercelulares de los queratinocitos basales. Las flechas están dispuestas en paralelo para señalar las mismas estructuras. Se utilizó un anticuerpo secundario marcado con Alexa flúor para la primera columna y con avidina marcada con Cy3 para la segunda. Barra de escala: 30 µm.
FIG. 7. --En las huellas de los queratinocitos se encuentran tetraspaninas e integrinas a3ß1. La señal es más intensa en los cultivos con calcio bajo ( < 0,1 mM) que calcio alto (2 mM). Barra de escala: 30 µm.
FIG. 8. --CD9 y CD81 colocalizan con integrinas ß1 en las uniones intercelulares, filopodios y huellas, pero no en los contactos focales. Se observa cómo CD9 y CD81 colocalizan con las integrinas ß1 valoradas con TS2/16 en uniones intercelulares, filopodios y huellas. Sin embargo, ambas tetraspaninas no colocalizan con HUTS-21, anticuerpo monoclonal que detecta las integrinas ß1 en conformación activa. Tanto HUTS-21 como el anticuerpo antitalina delimitan perfectamente los contactos focales. Las flechas están dispuestas en paralelo para señalar las mismas estructuras. Se utilizaron un anticuerpo secundario marcado con FITC para la primera columna y avidina marcada con Cy3 para la segunda. Barra: 20 µm.
FIG. 9. --Modelo de cicatrización de heridas. Situación a las 28 horas de haber provocado una herida en la monocapa de queratinocitos. Mientras que en el control los queratinocitos están cerrando el defecto, el uso de acm contra a3, CD81 o CD151 retrasa el proceso en distinto grado. Las placas se fijaron y se tiñeron con violeta-cristal.
FIG. 10. --Efecto inhibitorio de algunos anticuerpos monoclonales en el modelo de cicatrización de heridas. Los anticuerpos contra integrinas ß1 y a3 inhiben fuertemente la movilidad de los queratinocitos. Los anticuerpos anti-CD9 y alguno anti-CD81 también muestran un importante efecto, que es moderado con los anti-CD151. Unidades en micrometros cuadrados de herida cubiertos con queratinocitos a diversos tiempos en un área de 1.000 µm. Se muestra la media ± error estándar de los experimentos realizados por duplicado.
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Las integrinas son glicoproteínas heterodiméricas transmembrana que participan en la adhesión célula con célula y célula con matriz extracelular. Las tetraspaninas (CD9 y CD81) son proteínas transmembrana que colaboran en la transducción de señales y coprecipitan con la cadena ß1 de las integrinas. Hemos estudiado la regulación de la actividad de las integrinas ß1 monitorizando la conformación activa de dichas integrinas con anticuerpos monoclonales en queratinocitos humanos normales y hemos evaluado el papel de las tetraspaninas en el queratinocito. Hemos encontrado que los queratinocitos expresan integrinas ß1 en conformación activa, que esta expresión es modulable y que se correlaciona con un aumento en la adhesión. Además, en cultivo, la conformación activa se localiza exclusivamente en los contactos focales. Dado que en la psoriasis existe una expresión suprabasal anómala de integrinas β1, hemos estudiado la conformación activa y hemos encontrado que presenta una disminución en su expresión comparado con piel sana. Hemos visto que las tetraspaninas se colocalizan con integrinas β1 y α3 en las uniones intercelulares, filopodios y rastros de los queratinocitos, lugares donde las integrinas β1 están en conformación inactiva. Sin embargo, las tetraspaninas no se localizan con la conformación activa en los contactos focales. En un modelo de curación de heridas observamos que los anticuerpos antitetraspaninas eran capaces de inhibir la migración de los queratinocitos humanos normales. Es necesario reinterpretar el papel de las integrinas β1 en la psoriasis, así como su papel en las uniones intercelures. Las tetraspaninas parecen jugar un papel en la adhesión célula con célula y célula con matriz extracelular y en la migración.
Palabras clave:
Integrinas
Tetraspaninas
Adhesión
Migración
Queratinocitos
Integrins are transmembrane heterodimeric glycoproteins that are involved in cell-cell and cell-extracellular matrix adhesion. Tetraspanins (CD9 and CD81) are transmembrane proteins implicated in signal transduction pathways and coprecipitate with β1 integrins. We have studied the regulation of the functional state of β1 integrins monitoring the active conformation, using monoclonal antibodies, in normal human keratinocytes, and have evaluated the role of tetraspanins in keratinocytes. We have found that keratinocytes express β1 integrins in active conformation, that its expression can be modulated and it is related to an enhanced adhesion of keratinocytes. Moreover, in culture, integrins in active conformation are localized only in the focal adhesions. As anomalous suprabasal expression of ß1 integrins have been found in psoriasis, we have studied β1 integrin conformation and found that psoriasis shows a downregulation of β1 integrin activity compared with normal skin. We have seen that tetrapanins colocalize with β1 and α3 integrins at intercellular juctions, filopodia and footprints of keratinocytes, where β1 integrins are in inactive conformation. On the other hand, tetraspanins do not colocalize with the active conformation of β1 integrins in the focal adhesions. In a wound healing model, we have seen that anti-tetraspanins antibodies are able to inhibit the migration of normal human keratinocytes. A reinterpretation of the role of β1 integrins in psoriasis and intercelular adhesion is needed. Tetraspanins seems to have a role in the cell-cell and cell-extracellular matrix adhesions and in migration.
Keywords:
Integrins
Tetraspanins
Adhesion
Migration
Keratinocyte
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