Actas Dermosifiliogr., 1998;89:597-612

ESTUDIOS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO

Estudio citomorfométrico de las lesiones tumorales pigmentadas: análisis de la progresión tumoral*

E. HERRERA

L. VICIOSO*

M. ÁLVAREZ*

M. V. DE GALVEZ

M. MENDIOLA

P. SANCHEZ

A. MATILLA*

Servicio/Cátedra de Dermatología. *Servicio/Cátedra de Anatomía Patológica (Unidad de Citometría Analítica Computadorizada). Hospital Clínico Universitario. Facultad de Medicina de Málaga.

Correspondencia:

DR. ENRIQUE HERRERA. Cátedra de Dermatología. Facultad de Medicina. Campus de Teatinos. 29071 Málaga.

Aceptado el 15 de julio de 1998.

*Trabajo galardonado con el Premio August C. Stiefel 1997.

Resumen.--El origen del melanoma maligno (MM), bien «de novo», a partir de melanocitos de la capa basal, o bien vía nevo melanocítico adquirido (NMA), parece tener, en muchos casos, estadios intermedios que se conocen con el nombre de nevo displásico (ND), lo que se apoya en múltiples trabajos clínicos, histopatológicos y experimentales. Sin embargo, los criterios histopatológicos para el diagnóstico de ND, y aun su propia existencia, constituyen un problema ampliamente debatido.

Apoyándonos en técnicas de citomorfometría por análisis de imagen, mediante las cuales podemos obtener la ploidia de ADN y otros datos objetivos acerca de estas alteraciones celulares y su variación en diferentes tipos de lesiones, hemos estudiado 25 casos de MM, ND y NMA con el objetivo de conocer si las diferentes variables citomorfométricas permiten establecer un patrón de progresión neoplásica aplicable a las lesiones tumorales melanocíticas y, a su vez, encontrar en las variables citomorfométricas parámetros que nos ayuden a realizar un diagnóstico diferencial entre las distintas entidades.

Como resultados obtuvimos una frecuencia de aneuploida escasa en los NMA (un caso, 4%), moderada en los ND (siete casos, 28%), y mayoritaria en los MM (19 casos, 76%). De igual modo, observamos una desviación típica de la densidad óptica integrada (DOI) significativamente mayor (p < 0,05) en los ND que en los NMA, lo que puede correlacionarse con una mayor presencia de alteraciones cuantitativas de ADN en los núcleos de células de los ND. Los ND con ausencia o bajos grados de atipia fueron frecuentemente aneuploides (7 de 15).

Estos hallazgos nos inducen a concluir que los parámetros obtenidos por citomorfometría en lesiones melanocíticas apoyan la existencia de una progresión tumoral siguiendo la línea nevo melanocítico adquirido-nevo displásico-melanoma maligno, a la vez que plantean la posibilidad de que existan ND diploides sin potencial de malignización y ND aneuploides que sí lo conllevan.

Palabras clave: Tumores melanocíticos. Citometría. Progresión tumoral.

INTRODUCCIÓN

En la última década, el melanoma maligno (MM) ha sido uno de los tumores humanos que más rápidamente han aumentado en frecuencia, constituyendo un enorme problema de salud pública en muchos países occidentales (1). En estudios recientes de epidemiología analítica se ha observado que representa el 3% de todos los cánceres, tiene una incidencia media de la raza blanca de 20 por 100.000 habitantes y, en los últimos 30 años, ha multiplicado por más de 10 su incidencia (2).

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FIG. 1.--A) Nevo melanocítico adquirido en espalda. B) Nevo melanocítico compuesto con discreta actividad juntural y tecas en dermis superficial. C) Histograma diploide IADN = 1.

Su origen ocurre, fundamentalmente, a través de dos vías (3): a) «De novo», a partir de melanocitos de la capa basal; b) vía nevo melanocítico común, constituyendo un paradigma de progresión tumoral. Se supone que el 67% de los melanomas derivan de los primeros y el 23% de los segundos. Muchos piensan que ambos caminos pueden tener estadios intermedios, dando lugar a lo que se conoce con el nombre de nevo displásico, refiriéndose con este término a un modelo histológico de atipia citológica o arquitectural, intermedio entre los melanocitos basales de los nevos melanocíticos y de los melanomas.

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FIG. 2.--A) Síndrome de nevo displásico. B) Elongación de las redes de crestas con actividad melanocítica juntural y moderado grado de atipia. Discreto filtrado linfocitario. C) Histograma aneuploide IADN = 1,3 y 5cER nulo.

Por consenso se admitió que el nevo displásico (ND) es un precursor que puede progresar a MM (4, 5). Múltiples trabajos clínicos, histopatológicos y experimentales han intentado demostrar, con diferente éxito, la posibilidad de considerar al ND como una lesión intermedia entre el nevo melanocítico adquirido (NMA) y el MM (4, 6-9).

Barnhill (10), basándose en propiedades genéticas, inmunológicas, histopatológicas y clínicas, ha definido cinco estadios de progresión tumoral en el sistema melanocitario:

1. Neoplasias benignas, que se caracterizan por un modelo de crecimiento anormal pero sin atipias citológicas. Tienen mínima propensión hacia la malignización, excepto el nevo congénito gigante. Los identificaremos como nevo melanocíticos adquiridos.

2. Nevo displásico, con atipias arquitecturales y citológicas. Muchos lo consideran como un precursor potencial del melanoma maligno.

3. Melanoma maligno de crecimiento radial.

4. Melanoma maligno de crecimiento vertical.

5. Melanoma maligno metastásico.

Últimamente, con técnicas de experimentación animal, se ha podido reproducir esta progresión mediante la inducción de MM con radiaciones ultravioleta tipo UVB a la piel de un tipo de ratón susceptible de padecer melanoma. En primer lugar, se observó el desarrollo de nevos melanocíticos que posteriormente progresaron a estadios de nevo displásico y luego desarrollaron melanomas malignos (11).

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FIG. 3.--A) Melanoma de extensión superficial en pierna. B) Nidos de células de melanoma a nivel de epidermis y dermis superficial. En dermis profunda células névicas de nevo melanocítico preexistente. C) Histograma aneuploide IADN 1,5 y 5cER elevado.

Desde un punto de vista de epidemiología analítica también existen datos que apoyan esta forma de progresión. El riesgo acumulativo de padecer MM en el síndrome familiar del ND es, en 10 años, del 10,7% y, en 50 años, del 48,9%. En casos de ND esporádico el riesgo sería de 7-20% (12, 13).

El número de NMA es, también, un importante factor fenotípico de riesgo a padecer MM, existiendo una evidente relación, pues se ha demostrado que a mayor número de lesiones, mayor riesgo a padecer MM. Muchos autores consideran este hecho como guía epidemiológica del MM (9, 14, 15).

1. Aspectos clinicopatológicos de interés en la progresión tumoral de nevos a melanoma

Los nevos melanocíticos adquiridos son lesiones que no están presentes en el nacimiento. Conforman tumoraciones bien circunscritas que, histológicamente, muestran nidos de células névicas sin atipia ni citológica ni arquitectural (3).

El nevo displásico fue descrito por Clark en 1978 (16) como un síndrome familiar cuyo fenotipo es la presencia de múltiples lesiones pigmentadas atípicas, con o sin antecedentes de melanoma. El número de lesiones varía desde una o dos a varios cientos o más. De forma individual, la lesión clínica típica de nevo displásico es intermedia entre el NMA y el MM en cuanto al tamaño, forma y coloración (7, 16-18). Histopatológicamente, se observa atipia celular y/o arquitectural. Sin embargo, los criterios histopatológicos para su diagnóstico son muy debatidos y aún no hay un consenso general (19). Mientras más se discute, más confusión parece existir, a pesar de que ha habido varias conferencias de consenso patrocinadas por el Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos (5, 18) y por el Grupo Europeo de Cáncer Cutáneo (20).

El término displasia ha creado, y aún sigue creando, una fuerte controversia por lo que en la conferencia de consenso de 1992 (21) se recomendó que el término nevo displásico fuera abandonado y sustituido por el de nevo con desórdenes arquitecturales y/o atipia citológica.

Quizás el problema más importante y, con toda seguridad, el motivo de que se haya generado esta discusión, de enorme magnitud y aún no resuelta, es la gran dificultad que existe para diferenciar al ND que muestra displasia melanocítica marcada del MM microinvasor, pues faltan criterios reproducibles y aceptados por todos. Son muy demostrativas, al respecto, las contestaciones que obtuvo Jones (22) al preguntar a 48 expertos dermatopatológos cinco rasgos fundamentales para el diagnóstico de MM. Las respuestas fueron muy heterogéneas y controvertidas y generaron 50 criterios diferentes. La atipia citológica, aunque fue el criterio más frecuentemente indicado, no fue definida de forma clara y se relacionó con la forma, tamaño de la célula, del núcleo o bien con la morfología de los nucléolos.

2. La citomorfometría

Las técnicas de análisis de imagen, morfometría y citometría, desarrollan dos funciones fundamentales: a) reconocer y clasificar las células; b) cuantificar componentes celulares tales como el ADN, ARN y proteínas. Aunque pronto llegó a evidenciarse que el contenido total de ADN no podía discriminar de forma absoluta lesiones benignas, displásicas y malignas, sí se consiguió mostrar que los patrones de histogramas de ADN obtenidos mediante citrometría de imagen podían categorizar gran parte de dichas lesiones y utilizarse como factor pronóstico (23).

El análisis morfométrico permite, además de evaluar objetivamente las características de la célula neoplásica, ya conocidas por la dermatopatología convencional, medir los siguientes parámetros: a) incrementos del tamaño nuclear y de la relación núcleo/citoplasma; b) pleomorfismo nuclear; c) pérdida de polaridad; e) factores de forma, pseudoestratificación nuclear, etc. (24). De estas mediciones, el área nuclear es para algunos autores el parámetro más útil a la hora de correlacionarlo con la atipia celular (25). Estos datos también permiten identificar cambios estructurales benignos y/o malignos.

Quizás, el mayor interés que tiene la cuantificación del ADN es que permite estudiar el comportamiento biológico de los tumores, su crecimiento y desarrollo. Las células normales se caracterizan por un contenido de ADN y una organización cromosómica perfectamente estables. Las células malignas, por el contrario, muestran unos cambios genéticos que pueden manifestarse a nivel estructural o molecular, e incluyen modificaciones en el contenido de ADN.

Los modernos equipos de citometría interactiva utilizan sistemas de imagen TV combinados con un microscopio que permiten mediciones precisas del contenido nuclear de ADN, mediante la identificación y selección de núcleos individuales teñidos por la reacción de Feulgen. Los resultados obtenidos del análisis del ADN celular se representan en forma de histogramas, lo que permite identificar poblaciones clonales, o de similar contenido en ADN (26).

La cantidad de ADN o ploidia se mide en unidades arbitrarias y se expresan mediante índices de ADN (IADN). A partir del IADN se pueden clasificar las poblaciones tumorales en diploides, con un IADN igual o cercano a uno, y aneuploides cuando dicho valor es mayor.

La aplicación principal de la cuantificación de ADN en la clínica ha sido la relativa a su importancia como factor pronóstico. Algunos autores, como Herzberg (27) y Bibbo (28), encuentran impreciso el valor pronóstico de la ploidia de ADN en tumores de mama, colon, hígado, endometrio y melanomas. Cohen (29), por el contrario, refiere en un trabajo de revisión muy reciente que hay acuerdo general en considerar la aneuploidia de ADN como un factor independiente de mal pronóstico en melanomas, carcinomas de células pequeñas de pulmón, esófago, ovario, endometrio, próstata, vejiga y carcinoma papilar de tiroides.

La citometría de flujo, al igual que la citometría estática, permite detectar células aneuploides y evaluar el ciclo celular midiendo porcentualmente las células en cada fase. Es una técnica rápida, capaz de analizar 5.000-10.000 núcleos en pocos minutos, objetiva, cuantitativa y estadísticamente fiable. Una desventaja inevitable de la citometría de flujo, si la comparamos con la citometría estática, es que resulta una medida «a ciegas» de una muestra celular supuestamente tumoral, por lo que además no permite correlacionar las alteraciones citológicas encontradas por histopatología convencional en las células de interés, pues al utilizar suspensiones celulares se pierde el control visual de los objetos a cuantificar.

Sin embargo, la citometría de flujo y la citometría de imagen no deben ser consideradas como técnicas alternativas, sino como métodos complementarios de cuantificación, cada una con un espectro específico de aplicación. La citometría de imagen es ciertamente más efectiva en lesiones pequeñas, donde la selección celular es más necesaria, pero es menos competitiva para el análisis rutinario de ploidia de ADN y determinación de la fracción de células en proliferación (28).

3. Citomorfometría de las lesiones tumorales pigmentarias

El primer estudio realizado de citometría en lesiones tumorales pigmentarias fue realizado por Hansson en 1982 (30). Estudió, con citometría de flujo, 38 metástasis de melanoma y encontró un 79% de aneuploidia pero no halló significación en relación con la supervivencia. A partir de este momento, se han publicado algunos estudios en relación a la ploidia en nevos melanocíticos adquiridos (31-34), nevos congénitos (35-36), nevos displásicos (29, 34, 37-42), nevos de Spitz (37, 43-49) y melanomas (8, 34, 46-52).

También, con el fin de encontrar parámetros objetivos y medibles de la displasia celular, varios autores han intentando correlacionar la atipia celular con resultados citomorfométricos (36-38, 40, 53-55). En ambos casos, los resultados obtenidos son contradictorios y no hay acuerdos unánimes.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

El proceso de malignización conlleva, además de cambios en la morfología celular, la aparición de alteraciones en su genoma, tanto de índole cualitativo como cuantitativo, estas últimas generalmente consistentes en un aumento de la cantidad de ADN. La citometría permite conseguir datos objetivos acerca de estas alteraciones celulares y su variación en diferentes tipos de lesiones.

Por todo ello, el objetivo de nuestro trabajo será conocer las diferentes variables citomorfométricas de los nevos melanocíticos adquiridos, nevos displásicos y melanomas, con el fin de establecer un patrón de progresión neoplásica aplicable a las lesiones tumorales melanocitarias y, a su vez, encontrar en las variables citomorfométricas parámetros que nos permitan realizar un diagnóstico diferencial entre nevos melanocíticos, nevos displásicos y melanomas.

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Elección de la muestra

Se ha realizado un estudio analítico observacional, de carácter retrospectivo, en el que se incluyeron 75 pacientes que consultaron al Servicio de Dermatología del Hospital Clínico Universitario de Málaga, a los que le fueron extirpadas otras tantas lesiones tumorales pigmentadas: 25 nevos melanocíticos comunes, 25 nevos displásicos y 25 melanomas malignos. Los casos fueron elegidos al azar, con la única condición de que el grosor de la pieza anatomopatológica a estudiar tuviera más de 1 mm. El caso más antiguo data de 1990 y el más moderno de 1996.

2. Definición de las variables

Variables clínicas

En las lesiones névicas se protocolizó el sexo, la edad, evolución, localización, tamaño, superficie, contornos y fototipo del paciente. En el melanoma, además, se incluyeron la localización BANS, tipo clinicohistológico del melanoma primitivo y el estadio clínico en el momento de la consulta.

Variables histológicas

Para el diagnóstico de los ND nos guiamos por una serie de criterios mayores y menores (4, 6, 7, 17, 18, 20, 37, 56, 57) que a continuación exponemos:

1. Criterios mayores: a) criterio arquitectural: proliferación lentiginosa de los melanocitos y/o agrupación en nidos irregulares a nivel de la unión dermoepidérmica; b) criterio citológico: presencia de algún grado de atipia de los melanocitos intraepidérmicos.

2. Criterios menores: a) presencia de infiltrado linfocitario; b) fibroplasia concéntrica eosinofílica o en laminillas; c) extensión lateral del componente de unión (fenómeno de hombrera) o del componente dérmico.

El diagnóstico se estableció en base a la presencia de uno de los criterios mayores y dos o más de los criterios menores.

La atipia melanocítica se valoró de acuerdo al protocolo recomendado para el estudio histopatológico de estas lesiones por el EORTC (20). Se estudiaron las siguientes variables: presencia de atipia celular (porcentaje total de atipia celular); atipia arquitectural; cambios arquitecturales por la presencia o no de elongación y pérdida de las redes de crestas, presencia de puentes de melanocitos, actividad juntural, distribución anormal de pigmento, presencia del fenómeno de hombrera, fibroplasia laminar, neovascularización e infiltrado linfocitario; grado de atipia.

De la valoración de los anteriores resultados se llegó a catalogar a los ND, según el grado de atipia, en ausente, discreto, moderado y severo. Cuando no se encontró atipia citológica se le llamó ND con atipia arquitectural.

En los melanomas se determinaron los siguientes parámetros: componente lateral del melanoma; nivel de invasión de Clark y espesor del tumor o índice de Breslow.

Variables citomorfométricas

En los 75 tumores se determinó: área nuclear; densidad óptica integrada (DOI); análisis de los histogramas de la densidad óptica integrada (DOI). De su interpretación se obtuvieron los siguientes parámetros: índice de ADN (IADN) y 5cER (5c exceeding rate).

Con el fin de conseguir una buena reproducibilidad y estandarización de estas variables, fue necesario desarrollar distintos aspectos ligados a la preparación y análisis de las muestras que a continuación resumimos:

a) Reacción de Feulgen

De los mismos bloques de parafina seleccionados para el estudio histológico, se realizaron cortes de 5 micras, sobre los que se aplicó la tinción nuclear de Feulgen, que tiñe ADN con carácter estequiométrico, utilizando el kit para cuantificación de ADN de Becton Dickinson (CAS DNA staining). La muestra se somete a una reacción de hidrólisis ácida débil que separa las bases púricas (adenina y guanina) de la molécula de ADN, obteniéndose de esta forma grupos aldehídos libres, ausentes en la molécula de ADN intacta. En un segundo paso, el cromógeno, en nuestro caso azul de tionina, se une covalentemente al sustrato formado por los grupos aldehídos libres.

b) Fundamentos técnicos y metodológicos

de la cuantificación del ADN

La cuantificación del ADN mediante citometría de imagen, se basa en el principio definido en la ley de Lambert-Beer que afirma que: «cuando la intensidad de la tinción de un objeto aumenta, es mayor la pérdida en la cantidad de luz transmitida».

Para la evaluación del ADN nuclear se utilizó un sistema automático de análisis de imagen CAS 200 de Becton Dickinson. Dicho sistema consta de: a) un microscopio óptico convencional Reichert Diastar, equipado con una cámara de vídeo digital con un rango espectral de 380 a 1.100 nm y un tamaño de imagen digital potencial de 384 pixels (horizontal) por 491 pixels (vertical); b) dos monitores a color, uno para el manejo y selección de menús y otro para la representación en tiempo real de las imágenes microscópicas; c) una computadora IBM-AT, con 0,5 megabytes de memoria interna, 30 megabytes de memoria en disco duro y 1,2 megabytes de memoria en disco removible. Se ha utilizado el programa CMP (Cell Measurement Program) de Becton Dickinson.

La imagen microscópica de la preparación teñida con Feulgen se obtuvo con una lente de 40 aumentos ajustándose, de forma automática, la longitud de onda apropiada para dicha tinción. Tras la adquisición de la imagen digitalizada, la segmentación del objeto o núcleo se realizó por umbralización de la intensidad del gris hasta que la imagen mostrara núcleos completos. Se seleccionaron, por cada caso, 200 núcleos neoplásicos de la zona de mayor atipia. Otros 50 núcleos de queratinocitos, preferentemente parabasales, de la misma preparación y de zonas alejadas de la lesión fueron seleccionados, al objeto de obtener el valor diploide de comparación. De esta forma se determinó:

­ Área nuclear. En micras y mediante la siguiente fórmula:

­ Densidad óptica integrada (DOI). Se determina a partir del valor del gris medio de cada núcleo y se mide en unidades arbitrarias. Valora indirectamente la cantidad de ADN nuclear, al cuantificar la concentración de reactivo de Feulgen que se une al ADN del núcleo. El conjunto o suma de los valores densitométricos (DOI), de cada uno de los núcleos, han sido reflejados en cada caso en un histograma de barras, con valores en unidades arbitrarias (u.a.). De la interpretación de los histogramas se obtuvieron los siguientes parámetros:

Se consideró como diploide a la población celular cuyo IADN se encontraba entre los límites 0,80-1,20 y aneuploide si el IADN era mayor de 1,20.

­ 5cER (5c exceeding rate). Se calcula mediante los porcentajes de células tumorales con valores de ADN por encima de 5c, es decir, valores que exceden a aquellos de las células proliferantes. Este parámetro también se toma como medida de aneuploidia.

3. Análisis de los datos

Estadística descriptiva

a) Variables cualitativas

Se obtuvieron las frecuencias absolutas y relativas de las variables clínicas, histológicas y de ploidia de ADN.

b) Variables cuantitativas

Se obtuvieron la media, máximo, mínimo y desviación típica de las variables área nuclear, desviación típica de área nuclear, desviación típica del DOI (se expresa como DOI), índice de ADN y 5cER.

Estadística analítica

En nevos melanocíticos y nevos displásicos se valoraron: parámetros clínicos, histológicos y citométricos mediante estudios univariantes (*2 entre variables cualitativas y t de Student y ANOVA entre variables cuantitativas y cualitativas), estableciendo la significación estadística en p < 0,05.

RESULTADOS

Variables clinicopatológicas

De las variables clínicas (tabla I), destacó la incidencia elevada de mujeres, tanto en los nevos melanocíticos (80%) como en los ND (72%) y los MM (64%), aunque con una frecuencia decreciente.

En los ND, la localización en tronco era la más frecuente (45%) y el tamaño, en más de la mitad de los casos, no sobrepasaba de 0,5 cm. El 92% de las lesiones presentaban contornos irregulares y en un 60% de casos el paciente refería, como síntoma subjetivo, el aumento de tamaño. En dos casos el ND estaba asociado a MM y en uno había antecedentes familiares de MM. El 80% de pacientes presentó un fototipo II.

Respecto a los MM, casi la tercera parte de los MM ocurrieron a partir de los 50 años. Siete casos (28%) correspondieron a melanomas desarrollados sobre lesiones pigmentadas previas. El fototipo II fue el más frecuente en MM, ocurriendo en un 80% de casos.

El grado de atipia citológica encontrado en los ND, tras valorar los diferentes parámetros (tabla II), fue: a) un caso (4%) no mostró atipia citológica; b) en el 40% de casos, 10 pacientes, encontramos un grado de atipia discreto; c) en un 32% de casos, ocho pacientes, se halló un grado de atipia moderado; d) en un 28%, siete pacientes, se encontró un grado de atipia marcado.

Variables citomorfométricas

Desde el punto de vista del análisis citomorfométrico de la ploidia de ADN (tabla III) destacó que sólo una lesión NMA mostró aneuploidia con un IADN de 1,20 (peridiploide). En relación a los ND, siete (28%) fueron aneuploides y 18 (72%) diploides, mientras que en los melanomas observamos un 76% de aneuploides y un 34% diploides.

En cuanto a la media de índice de ADN, fue más elevada (1,37) en el MM que en el ND y el NMA (ambos 1,03). También el área media del MM fue considerablemente mayor que la del nevo displásico y melanocítico, y lo mismo ocurrió con el 5cER y la DOI (tabla IV).

La DT de todas las variables fue pequeña en los NMA, al igual que en los ND. Sin embargo, en los MM destacó una desviación típica de todas las variables elevada, que evidenciaba la existencia de grandes diferencias de tamaño de áreas y densintométricas entre las células del MM.

Tras el estudio comparativo de los resultados de ploidia de ADN con los diferentes parámetros clínicos observamos que en los ND la aneuploidia ocurría más frecuentemente en el varón y en la tercera década de la vida. Los ND aneuploides tenían mayormente una evolución menor de un año y un tamaño menor de 0,5 cm. En el resto de los parámetros clínicos no encontramos diferencias significativas entre ND diploides y aneuploides.

En relación al grado de atipia observamos que el único caso de ND que no presentó atipia citológica era diploide, al igual que los nueve casos que presentaban un grado de atipia discreta. Sin embargo, de los ocho casos con un grado de atipia moderado, cinco eran diploides y tres aneuploides; de los siete casos que tenían un grado de atipia marcado, tres eran diploides y cuatro aneuploides.

Respecto al resto de las variables citométricas, no se encontró relación significativa de ninguna de ellas con el grado de atipia, aunque el área nuclear media y DT del área nuclear fueron discretamente más elevadas en los grados mayores.

En los MM, desde el punto de vista histopatológico, destacó que niveles de Clark IV y V (16 pacientes, 64%) eran todos aneuploides, mientras que en índice de Breslow mayor de 3 mm (14 casos) la gran mayoría eran también aneuploides (11 casos). Se evidenciaron restos de nevos en siete casos (28%) sin relación con la ploidia. La mayor parte de los MM con infiltrados leves (11 casos, 44%) fueron aneuploides (10 casos). Dos pacientes, en el momento de la consulta, mostraban un estadio II y en los dos casos apareció un patrón aneuploide.

Relación entre el tipo de tumor y las variables

citomorfométricas

En la relación entre las diversas lesiones melánicas y las variables citomorfométricas, se advirtió, respecto al IADN, unos valores medios significativamente mayores en los MM que en los ND y en los NMA, no existiendo diferencias entre estos dos últimos (tabla V).

Igualmente, se advirtió un área nuclear media significativamente mayor en los MM que en los ND y NM, mientras que entre éstos fue muy similar (tabla VI).

La desviación típica del área nuclear resultó ser significativamente mayor en los MM que en las otras dos lesiones melánicas. Entre ND y NMA no existieron diferencias significativas, si bien los valores se acercaron al límite de la significación a favor de mayor DT del área nuclear en los ND (tabla VII).

También se observó una DOI (densidad óptica integrada; desviación típica) significativamente mayor en los MM que en los ND, y en éstos que en los NMA, lo que se correlaciona con una decreciente variación de la cantidad de ADN de las poblaciones celulares que conforman estas lesiones en el sentido de mayor a menor malignidad (tabla VIII).

Por último, los valores de 5cER fueron muy similares en ND y NMA, y significativamente mayores en MM que en los otros dos tipos histológicos de lesiones (tabla IX).

DISCUSIÓN

La mayor frecuencia de presencia de lesiones tumorales pigmentadas en el sexo femenino, creemos que es un hallazgo interesante y digno de discutir. Los NMA ocurrían en mujeres en un 80%, los ND en un 72% y los MM en un 64%. Estos hallazgos son también referidos en otros trabajos (14, 58, 59, 60) indicando como posibles causas factores hormonales, aún no aclarados, o mayor aparición de estas lesiones a nivel de las piernas, zona habitualmente no actínica en el hombre.

No hemos encontrado en la literatura ningún trabajo que relacione el sexo de los pacientes con la ploidia. En nuestra serie, si bien los ND aneuploides ocurren más frecuentemente en hombres, en los melanomas ocurre lo contrario.

La presencia de restos de nevo en melanomas la hemos encontrado en un 28% de casos, tanto clínica como histopatológicamente. Ninguno correspondía a nevo congénito de mediano o gran tamaño. En la literatura hemos recogido trabajos clínicos e histopatológicos que demuestran que el melanoma se puede originar en continuidad al nevo displásico, siendo diferentes las cifras que se dan al respecto. Así, por ejemplo, McGovern (61) encuentra restos de nevo en un 40% de los casos, Clark (4) en más del 29%, Ackerman (19) en menos del 5% y Friedman (62) en menos del 3%.

Para nosotros, la presencia de nevo en algunas lesiones de melanoma es un hecho incuestionable y pensamos que, si se realiza una búsqueda exhaustiva de células névicas mediante cortes seriados y tinciones con HMB-45 (antígeno que diferencia células de melanoma de células névicas profundas) las pequeñas proporciones encontradas por algunos autores aumentarían de forma considerable.

En relación a la presencia y grado de atipia arquitectural y citológica de nuestros nevos displásicos, y tras protocolizarlos siguiendo los criterios del EORTC (20), encontramos que un 40% de casos presentó un grado de atipia discreto, la tercera parte aproximadamente grado de atipia moderado y la cuarta parte un grado de atipia marcado, mientras que son escasos (4%) los nevos displásicos que sólo mostraron atipia arquitectural.

Si relacionamos el grado de atipia con los resultados obtenidos del estudio citomorfométrico de los ND vemos que todos los que sólo presentaban atipia arquitectural o un grado de atipia discreta eran diploides, mientras que la aneuploidia era frecuente en los ND con un grado de atipia moderado y aún más en los que presentaban un grado de atipia marcado.

La relación entre atipia celular y aneuploidia ha sido estudiada previamente con resultados controvertidos (7, 37-39, 54, 60, 64), pues no todos se han realizado con citometría de imagen que permite seleccionar las células a estudiar y por lo tanto correlacionar las imágenes histopatológicas con las de citometría.

Nuestros resultados muestran que todos los nevos displásicos aneuploides presentan un grado de atipia moderado o intenso y que más del 50% de los nevos displásicos con atipia moderada o intensa son aneuploides, lo que nos permite proponer la existencia de una relación entre aneuploidia y atipia celular.

Schmidt (54), realizando estudios similares a los nuestros, correlaciona ploidia con grado de atipia y divide a las lesiones tumorales melanocíticas en dos tipos: a) lesiones con ADN diploide (NPC, NPC con rasgos arquitecturales de ND y ND con poca y moderada atipia); b) lesiones con ADN aneuploide (ND con atipia severa, MM in situ y MM invasor). Nosotros no podemos corroborar totalmente esta clasificación, pues hemos encontrado ND con atipia severa y melanomas que eran diploides.

Respecto a las variables área nuclear media y DT del área nuclear, Bruij (38) ve diferencias significativas entre el ND con atipia severa y el resto de las lesiones névicas. En nuestro caso esta significación no se encontró, aunque la media de ambos parámetros fue discretamente más elevada que la del resto.

Del estudio de nuestros resultados del análisis citomorfométrico de los nevos melanocíticos destacamos que sólo una lesión, 4%, es aneuploide. Las características clínicas e histológicas de ella no se diferenciaban del resto.

También es interesante comentar que la desviación típica de todas las variables es muy pequeña, dato que nos indica la existencia de una similitud densitométrica y morfológica entre todas las células de los nevos melanocíticos.

En la bibliografía revisada encontramos resultados muy similares a los nuestros (31, 32, 34), si bien en los nevos melanocíticos congénitos de gran tamaño algunos autores (31, 35, 36) encuentran índices elevados de aneuploidia que correlacionan con la atipia y los interpretan como premalignos.

En relación a los resultados de citomorfometría obtenidos en los nevos displásicos, destacamos que el 28% fueron aneuploides y el 72% diploides. Estas cifras son similares a las encontradas por otros autores, tanto por citometría de flujo como por citometría de imagen (34, 37, 42). Otros, sin embargo, no encuentran aneuploidia (40, 53, 64).

Es evidente que existe controversia en relación al contenido de ADN en los nevos displásicos. Creemos que las diferencias que existen entre los diferentes estudios pueden ser debidas bien a que no existen criterios unánimes a la hora del diagnóstico histopatológico de este tumor que se sitúa entre el nevo melanocítico y el melanoma maligno, bien a que no todos los autores utilizan las mismas técnicas citomorfométricas.

Es muy interesante comentar que los datos aportados en los últimos trabajos publicados al respecto (34, 38, 54) coinciden con los nuestros debido a que han sido utilizados los mismos criterios diagnósticos y las mismas técnicas citomorfométricas.

Del estudio de las variables citomorfométricas del melanoma observamos que el 76% de los melanomas son aneuploides y el 24% diploides. Al contrario de lo que ocurría con el nevo melanocítico, la desviación típica de todas las variables es bastante elevada, dato que pone en evidencia las grandes diferencias densitométricas y de tamaño que existen entre los núcelos de las células del MM.

Los datos aportados por otros autores en relación a la ploidia del MM muestran cifras bajas en las series más antiguas en las que se ha utilizado citometría de flujo (35, 44, 48, 51, 65). A partir de 1991 se empezó a desarrollar la citometría de imagen (técnica en la que no es necesario un volumen tumoral importante y donde la medida de la célula anaplásica es más selectiva) consiguiéndose resultados de aneuploidia mucho más elevados y parecidos a los nuestros, pues oscilan entre el 76,1% y el 100% con un valor medio del 87,5% (34, 50, 52, 66-68).

Los resultados del estudio del análisis univariante de las variables citomorfométricas y el tipo de lesión tumoral, nos demuestran que los melanomas presentan un índice de ADN, área nuclear media, desviación típica del área nuclear, densidad óptica integrada (desviación típica) y 5cER significativamente mayores que los nevos displásicos y que los nevos melanocíticos adquiridos. A su vez, los nevos displásicos presentan una DOI (desviación típica) significativamente mayor que la de los nevos melanocíticos adquiridos. Los nevos melanocíticos y los displásicos no muestran diferencias significativas en relación al IADN, área nuclear media, desviación típica del área nuclear y 5cER.

Estos datos manifiestan que algunas de las entidades tumorales melanocitarias, claramente definidas desde el punto de vista histomorfológico, se caracterizan por modelos típicos de distribución de ADN, permitiendo diferenciar de forma significativa a las lesiones malignas de las lesiones premalignas y benignas.

Entre los nevos displásicos y nevos melanocíticos sólo hemos encontrado una diferencia significativa que se refiere a la variable DOI o desviación típica de la densidad óptica integrada. Éste es un parámetro que mide la absorbancia del núcleo o, lo que es lo mismo, la cantidad de tinción que absorbe. De esta forma a mayor absorbancia mayor densidad nuclear que es valorada en el histograma mediante el índice de ADN. Si la desviación típica de la DOI es elevada, es indicativo de que, en relación a la cantidad de cromatina, existe una diferencia importante de unos núcleos a otros o, lo que es lo mismo, que hay una desviación de la normalidad nuclear que se traduce histopatológicamente mediante atipias y displasias. Por consiguiente, hemos encontrado diferencias significativas en relación al contenido de cromatina nuclear entre los nevos displásicos y los nevos melanocíticos.

Todo lo anterior estaría apoyado en el hecho de que en el 28% de los nevos displásicos, el índice de ADN es aneuploide, mientras que aneuploidia sólo ocurre en el 4% de los nevos melanocíticos. Si bien no existen diferencias significativas entre los dos tipos de nevos y la ploidia, sí hemos hallado una tendencia que permitiría separar entre nevos displásicos aneuploides que tendrían potencialidad de transformación maligna y nevos diagnósticos diploides sin posibilidad de malignización. Probablemente el potencial de transformación maligna no sólo dependa de la aneuploidia por lo que, de acuerdo con Steinbeck (34), han de combinarse con otros factores, y entre ellos estaría la proliferación celular.

A pesar de todo lo expuesto, el nevo displásico sigue teniendo un papel controvertido en relación a su consideración como precursor de melanoma. De acuerdo con las actuales tendencias y apoyados en nuestros resultados, podemos sugerir que el nevo displásico representa una «diferenciación aberrante» impuesta por el proceso de maduración del nevo melanocítico adquirido, situándose como una lesión intermedia entre este último y el melanoma maligno (3, 54, 69).

CONCLUSIONES

De nuestros resultados podemos concluir que los parámetros obtenidos por citomorfometría en lesiones melánicas apoyan la existencia de una progresión tumoral siguiendo la línea nevo melanocítico adquirido-nevo displásico-melanoma maligno. Esta hipótesis, presumible por el hallazgo no infrecuente de restos de nevos en melanomas, como ocurrió en el 28% de nuestros casos, viene avalada por la frecuencia creciente de aneuploidia que hemos observado: escasa en los NMA, frecuente en los ND y mayoritaria en los MM. De igual modo, parece existir una mayor presencia de alteraciones cuantitativas de ADN en los núcleos de células de los ND que en los NMA, como lo demuestra una desviación típica de la densidad óptica integrada (DOI) significativamente mayor.

Además, esta progresión también puede constatarse si comparamos ausencia o bajos grados de atipia celular en los ND, diploides según nuestra experiencia, con grados moderados o alto, frecuentemente aneuploides. Estos hallazgos nos llevarían a contemplar la posibilidad de que existan ND diploides sin potencial de malignización y ND aneuploides con potencial de malignización.

Asimismo, consideramos la citometría de imagen como el método más adecuado para la valoración de la ploidia en las lesiones pigmentadas, ya que, entre otras razones, permite la selección de las células a medir, con lo que es posible correlacionar las alteraciones citológicas halladas en histopatología convencional, y trabajar con tumores poco gruesos.

Trabajos posteriores, en los que se combine la citomorfometría con inmunomarcadores de la proliferación celular u otros derivados de la biología molecular, podrán profundizar aún más en este controvertido tema de la progresión tumoral de las lesiones pigmentarias.

Abstract.--The origin of malignant melanoma (MM) from epidermal melanocytes or from acquired melanocytic naevus (AMN), seems to present in many cases intermediate stages known as dysplastic naevus (DN). This is supported by many clinic and hystopathologic reports, in spite of extensive discussion on the existence and diagnostic criteria of DN.

Based on cytophotometric techniques through image analysis, allowing the knowledgement of DNA-ploidy and some other objective data about cell alterations and their changes at different lesions, we have studied 25 cases of MM, DN and AMN in order to investigate if some cytomorphometric parameters allow us to know the neoplastic progression in tumour pigmentary lesions. In addition we try to stablish some cytomorphometric characteristics useful to differentiate these entities.

The results showed low aneuploidy presence at AMN (1 case, 4%), intermediate at DN (7 cases, 28%), and high at MM (19 cases, 76%). Furthermore, we demonstrated a significant high optical integrated density (OID) (p < 0.05), from DN to AMN, probably related to highest frecuency of DNA quantitative nuclei alterations at DN. DN with low or absent cell atypia were all diploids, whereas DNA with intermediate or high degree of atypia were frequently aneuploids (7 in 15 cases).

These findings give us the conclude that cytomorphometric parameters of melanocytic lesions support the existence of a tumour progression from acquired melanocytic naevus, dysplastic naevus and malignant melanoma, and they suggest the possible existence of dyploid DN without potential malignity and aneuploid DN with it.

Herrera E, Vicioso L, Álvarez M, De Gálvez MV, Mendiola M, Sánchez P, Matilla A. Cytomorphometric study of tumour pigmentary lesions: a tumour progression analysis. Actas Dermosifiliograf 1998;89:597-612.

Key words: Melanocytic tumours. Cytometry. Tumour progression.

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