CARTAS CIENTÍFICO CLÍNICAS
Microscopía confocal de fluorescencia ex vivo en escala de tres colores (mcf-3cs): una nueva técnica de imagen
Ex Vivo Fluorescence Confocal Microscopy on a 3-Color Scale: A New Imaging Technique
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Es una técnica que se ha aplicado sobre múltiples patologías dermatológicas, fundamentalmente sobre patología tumoral como el carcinoma basocelular (CB) o espinocelular. Esta tecnología puede aplicarse directamente sobre la piel (<span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span>), o sobre piezas que se hayan extirpado quirúrgicamente (<span class="elsevierStyleItalic">ex vivo</span>). En este último caso, el uso de fluoróforos ha conseguido mejorar la calidad de las imágenes obtenidas, en lo que se conoce como MC de fluorescencia (MCF).</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se han usado múltiples tinciones en MCF, como el azul de metileno o azul de toluidina; sin embargo, el naranja de acridina (NA) es el más usado<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>. El NA se une de forma específica al ADN y ARN de células vivas, actuando como un fluoróforo que se excita a una longitud de onda específica y emite fluorescencia. De esta forma, los núcleos celulares pueden ser resaltados, y se observan como estructuras brillantes blancas en los mosaicos de MCF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>. Por su parte, las estructuras que carecen de núcleo, como los haces de colágeno que forman parte de la dermis, emitirían una fluorescencia muy débil o nula. De esta forma, el NA mejora hasta 100 veces el contraste de las imágenes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>. Además, es importante señalar que el NA no degenera la muestra ni impide que sea posteriormente teñida con la clásica tinción de hematoxilina-eosina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>.</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hasta el momento, en las imágenes publicadas en la literatura de MCF, la fluorescencia emitida por el NA era traducida por el microscopio a una imagen final en escala de grises o bicromática<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>. A pesar del excelente contraste entre estructuras y la gran correlación histopatológica que muestran estas imágenes, los mosaicos finales en escala de grises resultan complejos de interpretar para dermatólogos y patólogos no expertos en MC.</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Recientemente nuestro grupo ha descrito una nueva técnica para la obtención de imágenes de MCF en escala de tres colores (MCF-3CS), mediante el uso conjunto del NA y bromuro de etidio (BE)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>.</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En esta técnica, las piezas extirpadas se introducen en nitrógeno líquido, lo que supone una congelación prácticamente instantánea. Posteriormente se secciona con el criostato en cortes rápidos de unos 20-30 μm de grosor. Tras ser seccionada la muestra se tiñe vertiendo sobre ella la mezcla de NA 0,1 mM y BE 0,25 mM, dejando actuar la solución durante un minuto. Tras este breve procesamiento la muestra se coloca en el microscopio confocal, modelo Nikon A1R<span class="elsevierStyleSup">+</span> (Nikon Corporation®, Japón), disponible comercialmente. Una vez situada en el microscopio la muestra es estimulada de forma simultánea por láser con dos longitudes de onda diferentes, 405 nm y 488 nm. El microscopio recoge la fluorescencia que emite la muestra tras ser estimulada, obteniéndose imágenes en escala de tres colores. Este proceso requiere unos 10-15 minutos hasta la obtención de los mosaicos a color finales.</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Estas imágenes a color son resultado de la acción conjunta de los dos fluoróforos aplicados sobre la muestra. El BE es un fluoróforo que se une de forma específica al ADN de células que han perdido la integridad de su membrana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>. El BE atraviesa las membranas nucleares dañadas tras el congelamiento, uniéndose con gran afinidad al ADN y tiñendo de esta forma los núcleos celulares. De esta forma, cuando la muestra es estimulada con láser a 405 nm, el BE emite fluorescencia roja, destacando con gran precisión dichos núcleos. Por su parte, la dermis y las estructuras anucleadas emiten fluorescencia verde que procede del NA tras ser estimulado a 488 nm. Por otro lado, la fluorescencia azul débil proviene de la fluorescencia intrínseca de los tejidos. Toda esta fluorescencia es recogida por el microscopio, y como resultado se obtienen las imágenes finales en escala de tres colores.</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se puede observar cómo se visualiza un fragmento de piel sana con esta técnica. Las estructuras nucleadas emiten fluorescencia roja, que contrasta significativamente con la fluorescencia verde, obteniéndose imágenes muy intuitivas y sencillas de interpretar, con una resolución muy alta. Esta alta resolución permite delimitar con gran precisión los límites de tumores cutáneos, como el CB que se muestra en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>a. Nótese la total correlación con la tinción con hematoxilina-eosina clásica (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>b). Tras el procesamiento, y en relación a las imágenes de H-E, no observamos cambios significativos en la calidad de las imágenes.</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La principal aplicabilidad de MC <span class="elsevierStyleItalic">ex vivo</span> en la actualidad es la relacionada con procesos quirúrgicos oncológicos, como la cirugía de Mohs. Es de esperar que en los próximos años se abaraten los dispositivos de MC haciéndolo una técnica más coste-efectiva y pudiendo incorporarse progresivamente a la práctica clínica habitual.</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En conclusión, las imágenes de MCF a color son significativamente más sencillas de interpretar que las imágenes en escala de grises para dermatólogos y patólogos no expertos en MC. Además, gracias al procesamiento mediante congelamiento la muestra está completamente aplanada, lo que permite obtener imágenes de la muestra completa, sin perderse mosaicos por pliegues de la misma. Todo esto supone importantes ventajas con respecto a las imágenes previas obtenidas con MC. No obstante, son necesarios más estudios que validen esta nueva técnica.</p><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0005">Financiación</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este trabajo no ha recibido ningún tipo de financiación.</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0010">Conflicto de intereses</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.</p></span></span>" "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:3 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Financiación" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Conflicto de intereses" ] 2 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "multimedia" => array:2 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 518 "Ancho" => 905 "Tamanyo" => 196452 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0005" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Fragmento de piel sana observada con microscopía confocal de fluorescencia a color.</p>" ] ] 1 => array:7 [ "identificador" => "fig0010" "etiqueta" => "Figura 2" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr2.jpeg" "Alto" => 2195 "Ancho" => 905 "Tamanyo" => 536570 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0010" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Carcinoma basocelular estudiado mediante microscopía confocal de fluorescencia a color (a). 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|---|---|---|---|
| 2024 Noviembre | 5 | 8 | 13 |
| 2024 Octubre | 151 | 53 | 204 |
| 2024 Septiembre | 164 | 24 | 188 |
| 2024 Agosto | 171 | 58 | 229 |
| 2024 Julio | 172 | 36 | 208 |
| 2024 Junio | 208 | 39 | 247 |
| 2024 Mayo | 182 | 42 | 224 |
| 2024 Abril | 145 | 24 | 169 |
| 2024 Marzo | 179 | 29 | 208 |
| 2024 Febrero | 136 | 29 | 165 |
| 2024 Enero | 116 | 30 | 146 |
| 2023 Diciembre | 125 | 13 | 138 |
| 2023 Noviembre | 158 | 39 | 197 |
| 2023 Octubre | 132 | 47 | 179 |
| 2023 Septiembre | 124 | 36 | 160 |
| 2023 Agosto | 87 | 15 | 102 |
| 2023 Julio | 91 | 41 | 132 |
| 2023 Junio | 77 | 24 | 101 |
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| 2023 Marzo | 112 | 26 | 138 |
| 2023 Febrero | 78 | 25 | 103 |
| 2023 Enero | 59 | 25 | 84 |
| 2022 Diciembre | 112 | 49 | 161 |
| 2022 Noviembre | 123 | 37 | 160 |
| 2022 Octubre | 116 | 39 | 155 |
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| 2022 Agosto | 101 | 46 | 147 |
| 2022 Julio | 102 | 43 | 145 |
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| 2022 Mayo | 154 | 59 | 213 |
| 2022 Abril | 64 | 31 | 95 |
| 2022 Marzo | 74 | 52 | 126 |
| 2022 Febrero | 55 | 28 | 83 |
| 2022 Enero | 76 | 47 | 123 |
| 2021 Diciembre | 84 | 33 | 117 |
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| 2021 Octubre | 104 | 51 | 155 |
| 2021 Septiembre | 78 | 43 | 121 |
| 2021 Agosto | 58 | 37 | 95 |
| 2021 Julio | 49 | 26 | 75 |
| 2021 Junio | 57 | 36 | 93 |
| 2021 Mayo | 48 | 41 | 89 |
| 2021 Abril | 336 | 104 | 440 |
| 2021 Marzo | 69 | 48 | 117 |
| 2021 Febrero | 72 | 33 | 105 |
| 2021 Enero | 79 | 28 | 107 |
| 2020 Diciembre | 49 | 35 | 84 |
| 2020 Noviembre | 49 | 23 | 72 |
| 2020 Octubre | 96 | 45 | 141 |
| 2020 Septiembre | 36 | 27 | 63 |
| 2020 Agosto | 28 | 37 | 65 |
| 2020 Julio | 46 | 57 | 103 |
| 2020 Junio | 13 | 28 | 41 |
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